This must be hidden
При поддержке препарата АФАЛАЗА

Информативность биоматериала для исследования микробиоты урогенитального тракта мужчин методом ПЦР РВ (пилотное исследование)

01.10.2019
198
0

Почерников Д.Г., Витвичкая Ю.Г., Болдырева М.Н., Галкина И.С.

Сведения об авторах:

  • Почерников Д.Г. – к.м.н., доцент кафедры факультетской хирургии и урологии ФГБОУ ВО «ИвГМА», urologkmn@mail.ru, AuthorID 414373
  • Болдырева М.Н. – д.м.н., медицинский директор Группы компаний «ДНК-Технология», boldyreva@dna-technology.ru
  • Витвицкая Ю.Г. – к.м.н., научный сотрудник Группы компаний «ДНК-Технология», vitvitskaya@dna-technology.ru
  • Галкина И.С. – к.х.н., директор по маркетингу Группы компаний «ДНК-Технология», galkina@dna-technology.ru

В последнее десятилетие особое внимание исследователей, а также практических врачей уделено бессимптомным инфекционно-воспалительным процессам урогенитального тракта мужчин, ассоциированным с условно-патогенными микроорганизмами (УПМ), встречающимися при бесплодии [1].

Выявление УПМ с помощью традиционных диагностических инструментов (микроскопическое, культуральное исследование) затруднено в силу объективных ограничений методов. По данным Европейской ассоциации урологов (EAU, 2019) с помощью рутинных методов диагностики УПМ удается выявить только в 5-10% случаев и, соответственно, только в 5-10% случаев имеется рациональная основа для проведения антибактериальной терапии [2]. В остальных случаях лечение проводится эмпирически с использованием многочисленных лекарственных препаратов длительными курсами и, с многочисленными побочными эффектами, хронизацией воспалительного процесса и возникновением осложнений. Хронические воспалительные процессы, в том числе в передней уретре, являются основной причиной таких осложнений как простатит, эпидидимит и орхит [3,4]. По данным Национального института здоровья (National Institutes of Health, США, 1999) у мужчин, страдающих урологическими заболеваниями, простатит выявляют у каждого четвертого пациента [5]. В 1995 году ими была предложена классификация простатита, которая является актуальной и на сегодняшний день, при этом простатит категории IV (асимптоматический простатит) встречается в 6-10% случаев [4,5].

Особого внимания заслуживает вопрос диагностики и лечения асимптоматического простатита. Развитие симптомов заболевания может быть обусловлено не только изменением качественно-количественного состава микроорганизмов, встречающихся в предстательной железе (ПЖ), но и быть результатом патологического взаимодействия психологических факторов и дисфункций иммунной, нервной и эндокринной систем [6,7]. Вследствие разнообразия клинических проявлений и различий в их степени выраженности, хронический простатит (ХП) относится к трудно диагностируемым заболеваниям. ХП может протекать изначально со слабовыраженной клинической симптоматикой на фоне длительно текущего воспаления или быть следствием постепенно стихающего воспалительного процесса после острого поражения ПЖ [8,9].

Количественные значения микроорганизмов при ХП в сравнении с острым процессом будут значительно меньше, т.к. УПМ подвергаются частичной элиминации из ПЖ, запустив процесс продуктивного воспаления, а оставшегося количества микроорганизмов достаточно для поддержания патологического процесса [10]. Однако только 10% ХП предшествуют острые простатиты, что еще больше затрудняет диагностику заболевания рутинными диагностическими методами [9].

Распространенный в лабораторной практике метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) является качественным исследованием и позволяет быстро и достоверно определить как возбудителей инфекций, передаваемых половым путем (ИППП), так и УПМ. Однако УПМ могут присутствовать в организме и в норме, поэтому качественное определение данных микроорганизмов не имеет диагностического значения. Именно поэтому современные клинические рекомендации указывают на важность определения не только вида возбудителя, но и его количества, титра [4,11-14].

С 2016 года в арсенале практикующего врача появился новыйметод выявления качественно-количественного соотношения УПМ в урогенитальном тракте мужчин и, соответственно, диагностики инфекционновоспалительных заболеваний, обусловленных не только основными ИППП, но и УПМ, основанный на методе ПЦР в режиме реального времени. Важное преимущество новой технологии – точное количественное определение компонентов микрофлоры, соответствующее содержанию бактерий в исследуемой локализации, по компонентам генома. Фактически результат анализа представляет собой «кальку» биотопа, включая количественные результаты по некультивируемым облигатным анаэробам, клинически значимым в развитии острых и хронических форм заболеваний репродуктивной системы мужчин. Методика определения качественно-количественного составамикроорганизмов, встречающихся в мужской мочеполовой системе, основанная на ПЦР в режиме реального времени, может использоваться для оценки инфекционного фактора при бесплодии, в том числе и при лейкоцитоспермии, в обследовании при подготовке к ЭКО, случаях неэффективного лечения острых и хронических форм урологических заболеваний.

На исследование могут быть направлены различные виды биоматериала (эякулят, секрет ПЖ, соскоб уретры, постмассажная моча). Выбор материала зависит от локализации инфекционного процесса: при уретрите целесообразно получать соскоб из уретры, баланите/баланопостите – соскоб головки полового члена, везикулите – эякулят, простатите – секрет ПЖ, постмассажную мочу, биоптат. Учитывая, что секрет ПЖ, содержащиймикроорганизмыпредстательной железы, является одной из составляющей эякулята, зачастую для диагностики инфекционно-воспалительного процесса в предстательной железе используют эякулят

Определение микробного «пейзажа» эякулята и секрета предстательной железы, а также сравнение информативности исследования биоматериала различных локализаций УГТ при бессимптомномтечении хронического простатита методом ПЦР в режиме реального времени явилось целью данной работы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В урологической клинике ФГБОУ ВО «ИвГМА» было обследовано 22 мужчины в возрасте от 30 до 55 лет (средний возраст составил 38,45 ± 7,25 лет), обратившихся по поводу бесплодия и с целью прегравидарной подготовки. Критерии включения в исследование: отсутствие ИППП на момент исследования, отсутствие жалоб и клинической симптоматики на момент исследования при наличии хронического бессимптомного течения простатита, отсутствие незащищенных половых контактов в течение 3 суток до процедуры, для снижения риска «выбраковки» биоматериала изза превышения пороговых значений транзиторной микрофлоры, а также наличие письменного информированного согласия на проведение исследований. Всем пациентам были проведены: сбор анамнеза, жалоб, клинический осмотр, пальпаторное исследование предстательной железы, лабораторная диагностика: трансректальное ультразвуковое исследование (ТРУЗИ) предстательной железы, микроскопическое исследование секрета ПЖ выполненное с помощью светового микроскопа при увеличении ×400 (объектив ×40, окуляр ×10). ПЦР в режиме реального времени проводили с помощью теста «Андрофлор®» (ООО «НПО ДНК-Технология», Россия) на приборе «ДТпрайм» (ООО «НПО ДНК-Технология», Россия). Для исследования методом ПЦР в режиме реального времени материал получали в течение одного дня из трех точек возможной локализации инфекционно-воспалительного процесса: соскоб из уретры, эякулят, секрет предстательной железы. Соскоб из уретры получали одноразовым стерильным урогенитальным зондом, вводя его в уретру на 3-4 см и совершая вращательные движения к наружному отверстию. Материал помещали в пластиковую пробирку объемом 1,5 мл объемом типа Эппендорф с 1,0 мл транспортной среды («Транспортная среда с муколитиком», ООО «ИнтерЛабСервис»). Круговыми движениями зонд споласкивали, отжимали избыток жидкости о края пробирки, зонд утилизировали. Пробирку центрифугировали при 13000 об/мин в течение 10мин, удаляли надосадочную жидкость (осадок + жидкая фракция), оставив в пробирке примерно 50мкл.Секрет ПЖполучали послемассажа ПЖв контейнер лабораторный для проб с завинчивающейся крышкой и ложкой. Эякулят мужчина получал путем мастурбации в лабораторный контейнер для проб.Для исследования спермы, секрета ПЖ, 20-30 мкл жидкого материала переносили с помощи пипетки в пластиковую пробирку объемом 1,5 мл типа Эппендорф с 1,0 мл транспортной среды («Транспортная среда с муколитиком», ООО «ИнтерЛабСервис»), центрифугировали пробирку при 13 000 об/мин в течение 10 мин, удаляли надосадочную жидкость, оставив в пробирке примерно 50 мкл, которую использовали для последующего выделения ДНК.

Надосадочную жидкость использовали для последующего выделения ДНК с помощью комплекта реагентов ПРОБА-ГC-ПЛЮС (ООО «НПО ДНКТехнология», Москва) в соответствии с инструкцией производителя.

Учитывая, что все пациентыдлительное время обследовались и лечились в ФГБОУ ВО «ИвГМА» на момент исследования всем пациентам был установлен основной диагноз «Бессимптомный воспалительный простатит IV».

Клиническая трактовка результата осуществлялась по относительным показателям – доли группы микроорганизмов в общей бактериальной массе, что нивелирует ошибки интерпретации по абсолютным количествам, фиксируя только достоверные различия в структуре микрофлоры.

Статистический анализ проведен с использованием пакета прикладных программ Microso Excel 2013 и Statistica 10.0 (StatSoft, Inc., США). Статистическую значимость различий анализировали с помощью критерия Фишера, различия считали значимыми при p<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Все мужчины 22 (100%) были пациентами клиники в течение длительного времени. При изучении анамнеза было установлено, что более половины пациентов предъявляютжалобына бесплодие (14; 63,63%), в т.ч и вторичное (3; 13,64%). Перенесенные ИППП в анамнезе были у 4 (18,18%) пациентов, при этом, более одного полового партнера указывали также 4 (18,18%) мужчин. При изучении воздействия экзогенных факторов 5 (22,72%) пациентов сообщили, что выкуривают до 1 пачки сигарет в день; 1 (4,54%) указал на воздействие производственных вредностей; алкоголь принимают в умеренных количествах 15 (68,11%) пациентов, исключили прием алкоголя 7 (31,89%) пациентов. Регулярно стрессовые воздействия испытывают 11 (50%) пациентов, редко – 6 (27,27%), не испытывают – 5 (22,72%)мужчин.Такимобразом, исходя из полученных нами данных анамнеза, можно предположить, что стресс – наиболее частый патогенетическийфактор риска хронического воспалительного процесса, воздействующий на исследуемую группу.

При исследовании гормонального статуса в 59,09% (n=13) случаев было выявлено нарушение последнего, что также может оказывать влияние на состав биоты урогенитального трактамужчин и требует дальнейшего изучения. 

Следует отметить, что на момент обследования у всех пациентов клиническая симптоматика отсутствовала и единственной жалобой было бесплодие.

По результатам ТРУЗИ в 86,36% (n=19) случаев были выявлены признаки хронического простатита.

Примикроскопическомисследовании секрета предстательной железы повышение лейкоцитов было выявлено у 9 (40,9%) пациентов, эритроцитов – в 2 (9,09%) случаях. Лецитиновые зерна в большом количестве были обнаружены у 10 (45,45%) мужчин, снижение количества лецитиновых зерен до умеренных значений выявлено у 8 (36,36%) пациентов, небольшое количество и отсутствие диагностировано в 4 (18,18%) случаях. Таким образом, по совокупности выявленных показателей микроскопические признаки воспаления были выявлены в 45,46% (n=10) случаев, абсолютная норма примикроскопии ПЖ– у 12 (54,54%) пациентов.

Результаты исследования соскоба из уретры, секрета ПЖ и эякулята с помощью ПЦР в режиме реального времени у пациентов с нормальным результатом микроскопии секрета ПЖ не выявили инфекционного процесса ни в одномисследуемом отделе лишь у трех (13,64 %) мужчин, однако все трое предъявляли жалобы на бесплодие, которое, вероятно, было обусловлено у двоих пациентов варикоцеле, у одного присоединением аутоиммунного компонента.

У 8 (36,36%) мужчин с абсолютной нормой при микроскопии методом ПЦР РВ в соскобе из уретры был выявлен «Дисбиоз»: у 6 (27,27%) пациентов, в соскобе из уретры был выявлен дисбиоз без указания степени выраженности, т.е. общая бактериальная масса не превышала 105 , у двоих (9,09%) – «Дисбиоз умеренный» и «Дисбиоз выраженный». У 5 (22,73%) пациентов при наличии дисбиоза в уретре, результатыисследования эякулята и секрета ПЖ соответствовали норме. У 2 (9,09%) пациентов при наличии дисбиоза в уретре, дисбиоз был выявлен в секрете ПЖ при показателях нормы в эякуляте; у одного – и в секрете ПЖ, и в эякуляте.

У пациентов, имеющих признаки инфекционно-воспалительного процесса по результатам микроскопии секрета ПЖ (10; 45,45%), с помощью метода ПЦР РВ были получены следующие результаты: дисбиоз в соскобе из уретры выявлен в 7 (31,82%) случаях: в 4 (18,18%) случаях без указания степени выраженности; в 2 (9,09%) – «Дисбиоз выраженный»; в одном – «Дисбиоз умеренный». При наличии дисбиоза в уретре последний в секрете ПЖ был выявлен у 3 (13,63%) пациентов, в соскобе из уретры, эякуляте, секрете ПЖ только у 2 (9,09%) пациентов. В остальных случаях 2 (9,09%) зафиксирован вариант нормы.

У троих (13,63%) пациентов при наличии признаков инфекционно-воспалительного процесса в микроскопическом исследовании секрета ПЖ метод ПЦР РВ дисбиотических изменений не выявил.

На рисунке 1 представлены данные выявленных микроорганизмов и средние титры в зависимости от локализации полученного материала.

Рис. 1. Динамика выявления микроорганизмов и средних титров в зависимости от локализации полученного материала

По результатам теста Андрофлор® наименьшее значение бактериальной обсемененности в геном-эквивалентах (ГЭ) идентифицировано в эякуляте 3±1,3 ГЭ, в секрете ПЖ данный показатель составил 3,9±1,3. ГЭ, в уретре выявлено наибольшее значение 4,5±1,3 ГЭ. Больше чем у половины мужчин в уретре встречались Corynebacterium spp., Eubacterium spp., Anaerococcus spp. и Staphylococcus spp., при этом в эякуляте и секрете предстательной железы эти бактерии выявлялись значительно реже. Одинаково часто, как в эякуляте, так и в уретре встречались Lactobacillus spp. Ureaplasma parvum чаще встречалась в эякуляте, чем в секрете предстательной железы и уретре. Стоит отметить, что Sneathia spp./Leptotrichia spp./Fusobacterium spp. и Gardnerella vaginalis идентифицированы только в уретре и не обнаружены в секрете ПЖ и эякуляте. При статистическом анализе полученных результатов отмечается отсутствие статистически значимых различий в выявляемостимикроорганизмов в секрете ПЖ и эякуляте, но это, по-видимому, связано с недостаточной выборкой, имеются статистически значимые различия между биотопом эякулята и уретры (p<0,05), а также в биотопах секрета ПЖ и уретры (p<0,05).

ОБСУЖДЕНИЕ

Известно, чтомикроорганимына поверхности уротелия преимущественно существуют в виде биопленки, планктонные формы малочисленны, поэтому для получения адекватного результата исследования необходимо получать не отделяемое, а соскоб эпителиальных клеток с прикрепленным к ним участком биопленки

В нашем исследовании были отмечены случаи несовпадения микробного пейзажа нижних и верхних отделов УГТ (дисбиоз различной степени выраженности в уретре против нормоценоза микрофлоры секрета ПЖ и эякулята). Можно предположить, что при прохождении эякулята или секрета ПЖ через уретру недостаточно для массивного обсеменения эякулята и секрета ПЖ микроорганизмами, находящимися в просвете уретры, т.к. при прохождении секрета ПЖ или эякулята через уретру биоматериал захватывает только часть микроорганизмов, большая часть которых плотно фиксирована в составе биопленки. Наличие в клинической трактовке исследования с помощью метода ПЦР РВ такой возможности как оценка состояния биоценоза по относительным показателям позволяет нивелировать искажения, фиксируя только достоверные различия в структуре микрофлоры.

Наличие дисбиоза в уретре поддерживает течение хронического процесса, что согласуется с данными литературы [1,3]. Учитывая, что передняя уретра – источник восходящей инфекции, обследование пациента всегда необходимо начинать с оценки состояния биоты передней уретры. Анализ полученных результатов показал, что при наличии патологического процесса в ПЖ, подтвержденный тестом ПЦР РВ с заключением «Дисбиоз выраженный», аналогичные результаты, но с меньшей степенью выраженности были зафиксированы и в заключении исследования эякулята. При получении результата «Дисбиоз умеренный» при исследовании секрета ПЖ, в заключении исследования эякулята мы получали норму или невозможность указания степени дисбиоза вследствие снижения уровня общей бактериальной массы ниже 105 .

Таким образом, на основании полученных данных, мы считаем, что для выявления этиологического фактора инфекционно-воспалительного процесса, локализующегося в предстательной железе, при хронических вялотекущих процессах, при выборе вида биоматериала между эякулятом и секретом предстательной железы, предпочтение необходимо отдавать секрету ПЖ.

Те пациенты, у которых при исследовании секрета ПЖ не было выявлено качественно-количественного дисбаланса УПМ при наличии микроскопических признаков воспаления в секрете ПЖ требуют дальнейшего обследования для выявления этиологического фактора возникновения воспалительной реакции.

ВЫВОДЫ

1. При обследовании 22 пациентов с диагнозом«Бессимптомный воспалительный простатит IV» и одномоментном исследовании материала из уретры, эякулята и секрета ПЖ было выявлено, что передняя уретра у мужчин может выступать в качестве резервуара хронической инфекции, не вызывая клинических проявлений, поэтому обследование пациента всегда необходимо начинать с оценки состояния биоты передней уретры.

2. Для выявления хронического малосимптомного патологического процесса в предстательной железе во избежание гиподиагностики, несвоевременного лечения и, соответственно, развития осложнений, при выборе материала для исследования между эякулятом и секретом ПЖ, предпочтение необходимо отдавать секрету ПЖ. Безусловно, было обследовано небольшое количество пациентов, вследствие того, что не все мужчины давали согласие на получение материала в течение одного дня из трех точек возможной локализации патологического процесса, поэтому для подтверждения полученных нами результатов необходимо проведение дальнейших исследований, используя новую прогрессивную методику, основанную на количественном определении компонентов биоты УГТ, соответствующее содержанию бактерий в исследуемой локализации с помощью метода ПЦР в режиме реального времени.

ЛИТЕРАТУРА

  1. Курило Л.Ф. и соавт. Влияние бессимптомных инфекций урогенитального тракта на показатели эякулята у мужчин с бесплодием и варикоцеле. Андрология и генитальная хирургия. 2016; 17(2): 98-103. doi:10.17650/2-070-9781-2016-17-2-98-103.
  2. Guidelines on Urological infections© / G. Bonkat, R.R. Bartoletti[et. al.]// European Association of Urology 2019. http://www.uroweb.org/guidelines.
  3. Ashok Agarwal, R. John Aitken, Juan G. Alvarez Editors. Studies on Mens Health and Fertility. HumanPress, LLC 2012. Р. 671. Doi: 10.1007/978-1-61779-776-7
  4. Клинические рекомендации по андрологической урологии/ под ред. П. А. Щеплева. М.: Медфорум. 2016. 120 с.
  5. Krieger JN, Nyberg LJr, Nickel JC. NIH consensus definition and classification of prostatitis. JAMA 1999; 282: 236–7.
  6. 6. Magri V, Wagenlehner F, Perletti G, Schneider S, Marras E, Naber KG, Weidner W. Use of the UPOINT chronic prostatitis/chronic pelvic pain syndrome classification in European patient cohorts: sexual function domain improves correlations. J Urol. 2010 Dec;184(6): 2339-45. doi: 10.1016/j.juro.2010.08.025
  7. Nickel J.C. Is chronic prostatitis/chronic pelvic pain syndrome an infectious disease of the prostate? Investig Clin Urol. 2017 May; 58(3): 149-151. https:// doi.org/10.4111/icu.2017.58.3.149.
  8. Коган М.И., Мационис А.Э., Белоусов И.И., Повилайтите П.Е. Морфологические доказательства ишемической природы фиброза предстательной железы при классическом синдроме хронической тазовой боли/хроническом простатите IIIБ. Урология. 2018; (3): 12-18. doi:10.18565/urology.2018.3.12-18
  9. Magri V. et al. Multidisciplinary approach to prostatitis. Arch Ital Urol Androl. 2019 Jan 18; 90(4):227-248. doi: 10.4081/aiua.2018.4.227.
  10. Schuppe H.C. et al. Urogenital Infection as a Risk Factor for Male Infertility. Dtsch Arztebl Int. 2017 May 12;114(19):339-346. doi: 10.3238/arztebl.2017.0339.
  11. Яковлев С.В., Рафальский В.В., Сидоренко С.В., Спичак Т.В. Стратегия и тактика рационального применения антимикробных средств в амбулаторной практике: Евразийские клинические рекомендации. М.: Пре100 Принт; 2016; 144.
  12. Рахматулина МР, Соколовский ЕВ, Малова ИО, Серов ВН, Аполихина ИА, Мелкумян АГ. Федеральные клинические рекомендации по ведению больных хламидийной инфекцией. Акуш. и гин. 2016; (4 Прилож.): 57-63.
  13. Перепанова ТС, Козлов РС, Руднов ВА, Синякова ЛА. Антимикробная терапия и профилактика инфекций почек,мочевыводящих путей имужских половых органов. Федеральные клинические рекомендации. М: 2015; 72.
  14. Урология. Российские клинические рекомендации/ под ред. Ю.Г. Аляева, П.В. Глыбочко, Д.Ю. Пушкаря. М. «Медфорум»: 2018:544 с.

Статья опубликована в журнале "Экспериментальная и клиническая урология" №2 2019 г., стр. 128-133

Тематики и теги

Комментарии

Журнал "Экспериментальная и клиническая урология" Выпуск №2 за 2019 год
Журнал "Экспериментальная и клиническая урология" Выпуск №2 за 2019 год
Выпуски