С.В. Чигринец^{1, 2}, Г.В. Брюхин¹

¹ ФГБОУ ВО «Южно-Уральский государственный медицинский университет» Минздрава России; Россия, 454092 Челябинск, ул. Воровского, 64;
² ООО «ДНК клиника»; Россия, 454048 Челябинск, ул. Яблочкина, 3

Введение

Бесплодие – важная медико-социальная проблема. Известно, что мужской фактор (патозооспермия – нарушение качества эякулята) выявляют примерно в 50 % бесплодных пар, причем на долю идиопатической формы мужского бесплодия приходится не менее 30 %, а доля бессимптомной урогенитальной инфекции, по данным E. Nieschlag [1], составляет 8 %. Среди вероятных причин идиопатической формы бесплодия рассматриваются: генетические факторы, воздействие активных форм кислорода и эндокринных дисрапторов [1].

Связь условно-патогенной урогенитальной инфекции с качеством эякулята широко изучается в настоящее время с помощью полимеразной цепной реакции, хроматографии с масс-спектрометрией или высокопроизводительного секвенирования (next-generation sequencing) [2–4]. Хорошо известна роль условно-патогенных микроорганизмов в метаболизме ксенобиотиков [5, 6], а также их способность вызывать гибель клеток, в частности апоптоз сперматозоидов [7–9]. Вместе с тем отсутствуют убедительные данные о том, при каких условиях условно-патогенная микрофлора урогенитального тракта способна оказывать влияние на качество эякулята и становиться причиной мужской субфертильности или инфертильности.

Влияние на качество эякулята убиквитарных эндокринных дисрапторов, к которым относятся бисфенол А и триклозан, активно обсуждается в научной литературе [10–12]. Однако нам не встретились публикации, посвященные изучению связи между микробиотой урогенитального тракта, эндокринными дисрапторами и фертильностью мужчины.

Цель исследования – установить связь между наличием условно-патогенных микроорганизмов уретры и качеством эякулята, а также концентрацией убиквитарных эндокринных дисрапторов (бисфенола А и триклозана) в семенной жидкости.

Материалы и методы

С октября 2017 г. по сентябрь 2018 г. на базе «ДНК клиники» (Челябинск) проведено обсервационное одноцентровое одномоментное (поперечное) неконтролируемое исследование с участием 63 мужчин. Пациенты обратились в клинику для выполнения спермиологического анализа по поводу бесплодия в браке, невынашивания беременности партнершей, а также для планирования беременности или донорства спермы. Все пациенты были жителями Челябинска или Челябинской области

Критерии включения в исследование: мужской пол, возраст 20–40 лет, наличие идиопатической формы бесплодия, наличие репродуктивных потерь у супружеских пар с патозооспермией, бессимптомный дисбиоз уретры, планирование беременности супружескими парами с нормозооспермией, участие в донорстве спермы, информированное добровольное согласие на включение в исследование.

Критерии исключения из исследования: варикоцеле, инфекционно-воспалительные заболевания урогенитального тракта, вызванные патогенными и/или условно-патогенными микроорганизмами, лейкоспермия, MAR-тест >10 % по данным спермограммы, азооспермия, гипогонадизм и другие эндокринные заболевания, онкологические заболевания любой локализации, ВИЧ-инфекция, системные заболевания, отсутствие информированного добровольного согласия на включение в исследование.

Проводили лабораторное исследование эякулята и содержимого уретры. Эякулят собирали после 3–4 дней воздержания от семяизвержений. Забор содержимого уретры для исследования на наличие инфекции и воспаления осуществляли не менее чем через 3 ч после последнего мочеиспускания. Для исключения патологий органов мошонки (варикоцеле и др.) выполняли ультразвуковое исследование органов мошонки на аппарате Mindray DC-7 (Китай) в положении пациента лежа и стоя во время андрологического приема.

У всех пациентов проведено спермиологическое исследование с оценкой общего количества, концентрации, подвижности, морфологии сперматозоидов по Крюгеру. Спермиологическое исследование выполняли в соответствии с рекомендациями Всемирной организации здравоохранения (2010) [13]. Заключение о наличии нормозооспермии или патозооспермии основывали на критериях, изложенных в тех же рекомендациях [13].

По результатам оценки качества 63 образцов эякулята мужчины были распределены по 2 группам: в 1-ю вошли пациенты с нормозооспермией (n = 27), во 2-ю – с патозооспермией (n = 36).

Содержимое уретры исследовали методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени с использованием тест-системы «Андрофлор». Тестсистема «Андрофлор» позволила сформировать 3 кластера микроорганизмов:

1. «нормальная микрофлора» (Staphylococcus spp., Streptococcus spp., Corynebacterium spp., а также были включены Lactobacillus spp.);
2. «условно-патогенные микроорганизмы, ассоциированные с бактериальным вагинозом» (Gardnerella vaginalis, Megasphaera spp./Veilonella/Dialister spp., Sneathia spp./Leptotrichia spp./Fusobacterium spp., Ureaplasma parvum, Ureaplasma urealyticum, Mycoplasma hominis и Atopobium cluster);
3.  «условно-патогенные анаэробы» (Anaerococcus spp., Bacteroides spp./Porphyromonas spp./Prevotella spp., Peptostreptococcus spp./Parvimonas spp., Eubacterium spp.).

Haemophilus spp., Pseudomonas aeruginosa/Ralstonia spp./ Burkholderia spp., Enterobacteriaceae spp./Enterococcus spp., а также Candida spp. ввиду их малочисленности в изучаемых образцах не позволили сформировать отдельный кластер и поэтому в статистический анализ не вошли.

Концентрацию бисфенола А и триклозана в семенной жидкости определяли на газовом хроматографе с масс-спектрометром Shimadzu GCMS-QP2010 Ultra (Shimadzu Corporation, Япония). Данные обрабатывали с помощью программы GCMSsolution 4.3 (Shimadzu Corporation, Япония).

Результаты

Среди 63 пациентов, которые приняли участие в исследовании, было 27 (42,9 %) мужчин с нормозооспермией (планирующих беременность в браке или доноров спермы) и 36 (57,1 %) мужчин с идиопатической формой бесплодия и/или репродуктивными потерями в супружеской паре с различными вариантами патозооспермии: тератозооспермией – в 18 (50 %) случаях, астенотератозооспермией – в 12 (33,3 %), олиготератозооспермией – в 4 (11,1 %), олигоастенотератозооспермией – в 2 (5,6 %).

Средний возраст пациентов (М ± σ) составил 30,8 ± 3,6 года, средний индекс массы тела (ИМТ) (М ± σ) – 25,4 ± 2,9 кг/м2 , при этом 42 % мужчин имели избыточную массу тела (ИМТ 25–30 кг/м2 ) и 11 % – ожирение I степени (ИМТ >30 кг/м2 ). Группы пациентов с нормо- и патозооспермией были сопоставимы по возрасту, длительности воздержания от семяизвержений, ИМТ, статусу курения и приема алкоголя.

В 100 % образцов эякулята был обнаружен бисфенол А с медианной концентрацией 0,150 (0,060– 0,310) нг/мл. Триклозан был выявлен в 84,9 % образцов эякулята с медианной концентрацией 0,125 (0,050– 0,220) нг/мл.

Группы статистически значимо различались по концентрации бисфенола А (p <0,001) и триклозана (р = 0,032) в семенной жидкости: у мужчин с нормозооспермией концентрация бисфенола А оказалась меньше, чем у мужчин с патозооспермией, – соответственно 0,05 (0,04–0,08) и 0,21 (0,14–0,47) нг/мл. Аналогичные различия наблюдались и в концентрации триклозана в семенной жидкости – соответственно 0,08 (0,03–0,19) и 0,19 (0,11–0,40) нг/мл.

В результате обследования 63 образцов содержимого уретры установлено, что наиболее часто присутствовали Corynebacterium spp. (84,1 %), Eubacterium spp. (81,0 %), Anaerococcus spp. (71,4 %). Несколько реже выявляли Streptococcus spp. (63,5 %), Megasphaera spp./ Veilonella/Dialister spp. (58,7 %), Bacteroides spp./Porphyromonas spp./Prevotella spp. (49,2 %), Peptostreptococcus spp./Parvimonas spp. (46,0 %), Lactobacillus spp. (42,9 %), Staphylococcus spp. (39,7 %), Gardnerella vaginalis (30,2 %). Еще реже обнаруживали Ureaplasma parvum (20,6 %), Haemophilus spp. (14,3 %), Atopobium cluster (14,3 %), Enterobacteriaceae/Enterococcus spp. (14,3 %), Sneathia spp./Leptotrichia spp./Fusobacterium spp. (12,7 %), Ureaplasma urealyticum (7,9 %), Mycoplasma hominis (7,9 %) и Pseudomonas aeruginosa/Ralstonia spp./Burkholderia spp. (1,6 %). Общая бактериальная масса уретрального содержимого колебалась в пределах 103,4–100,1 (рис. 1).

Рис. 1. Средний титр микроорганизмов по общей бактериальной массе, 10n

Таблица 1. Общая бактериальная масса, количество видов бактерий и средний титр микроорганизмов у пациентов с нормозооспермией и патозооспермией, M ± σ

При сравнении групп по общей бактериальной массе, среднему титру микроорганизмов в 3 кластерах и их видовому разнообразию статистически значимых различий не обнаружено (табл. 1). Вместе с тем следует отметить незначительное увеличение общей бактериальной массы с одновременным уменьшением разнообразия микрофлоры в группе мужчин с патозооспермией.

Сравнительная характеристика микробиоценозов уретры при нормо- и патозооспермии изображена на рис. 2–4. Микроорганизмы были представлены 3 кластерами.

Рис. 2. Частота выявления микроорганизмов 1-го кластера в уретре при нормо- и патозооспермии

Рис. 3. Частота выявления микроорганизмов 2-го кластера в уретре при нормо- и патозооспермии

Рис. 4. Частота выявления микроорганизмов 3-го кластера в уретре при нормо- и патозооспермии

Различия между группами по 1, 2 и 3-му кластерам были статистически незначимыми (р >0,1), за исключением Atopobium cluster (p = 0,031), входившего во 2-й кластер.

Обращает на себя внимание тот факт, что у мужчин с патозооспермией частота выявления микробиоты 1-го кластера (Lactobacillus spp., Staphylococсus spp. и Corynebacterium spp.) была несколько выше, чем у мужчин с нормозооспермией. Микроорганизмы, включенные во 2-й кластер (Gardnerella vaginalis, Megasphaera spp./Veilonella/Dialister spp., Sneathia spp./Leptotrichia spp./Fusobacterium spp., Ureaplasma parvum, Ureaplasma urealyticum, Mycoplasma hominis и Atopobium cluster), встречались чаще у мужчин с нормозооспермией, тогда как микроорганизмы 3-го кластера (Anaerococcus spp., Bacteroides spp./Porphyromonas spp./ Prevotella spp., Peptostreptococcus spp./Parvimonas spp., Eubacterium spp.) несколько чаще встречались у мужчин с патозооспермией.

С помощью коэффициента ранговой корреляции Спирмена между концентрацией бисфенола A, триклозана в семенной жидкости и частотой выявления микроорганизмов в уретре у мужчин были обнаружены следующие статистически значимые корреляционные связи (табл. 2).

Таблица 2. Статистически значимые корреляционные связи между концентрацией бисфенола А, триклозана в семенной жидкости и обсемененностью уретры микроорганизмами

Обсуждение

В данном исследовании был использован метод полимеразной цепной реакции в режиме реального времени для характеристики разнообразия микробиоты уретры. Результаты показали отсутствие статистически значимых различий между группами мужчин с нормозооспермией и патозооспермией по составу микробиоты уретры. D. Hou и соавт. (2013) также не обнаружили статистически значимых различий при сравнении микробиоты у доноров спермы и бесплодных мужчин [14]. В их работе была выявлена отрицательная статистически значимая корреляция между качеством эякулята и наличием Anaerococcus, но в нашем исследовании Anaerococcus spp., наряду с другими анаэробными микроорганизмами (Bacteroides spp./Porphyromonas spp./Prevotella spp., Peptostreptococcus spp./Parvimonas spp., Eubacterium spp.), также встречался чаще у мужчин с патозооспермией, хотя связь и оказалась статистически незначимой. S.-L. Weng и соавт. [2] продемонстрировали положительную статистически значимую корреляцию качества эякулята с наличием Lactobacillus и Gardnerella vaginalis и отрицательную – с наличием Prevotella, что подтвердилось и в нашем исследовании. Из микроорганизмов, традиционно выявляемых в микробиоценозе влагалища, статистически значимо чаще в уретральном микробиоценозе у мужчин с нормозооспермией присутствовала Atopobium cluster.

Исходя из этого, следует предположить, что условно-патогенные микроорганизмы, ассоциированные с бактериальным вагинозом, можно рассматривать при дальнейшем изучении микробиоты урогенитального тракта у мужчин как биомаркеры хорошего качества эякулята, а условно-патогенные анаэробы – наоборот, как биомаркеры низкого качества эякулята. Вместе с тем в ходе исследования была обнаружена тенденция к повышению уровня общей бактериальной обсемененности уретры с сокращением ее видового разнообразия у мужчин с патозооспермией, что согласуется с данными других авторов [4]. В нашей работе впервые была описана статистически значимая связь между концентрацией бисфенола А, триклозана в семенной жидкости и характеристиками микробиоты уретры. В некоторых публикациях также было показано отрицательное влияние эндокринных дисрапторов на микробиоту организма человека [6, 15].

Заключение

В ходе исследования установлены статистически значимые различия в концентрации бисфенола А и триклозана в семенной жидкости у мужчин с нормо- и патозооспермией. Обнаружены статистически значимые положительные корреляции между концентрацией бисфенола А в семенной жидкости и наличием вмикробиоте уретры Lactobacillus spp. (r = 0,501, р = 0,003), Corynebacterium spp. (r = 0,425, р = 0,015), Anaerococcus spp. (r = 0,371, р = 0,045), Eubacterium spp. (r = 0,357, р = 0,037). В отношении концентрации триклозана в семенной жидкости были установлены 2 статистически значимые корреляции: с наличием Staphylococсus spp. (r = 0,392, р = 0,026) и Streptococcus spp. (r = –0,486, р = 0,005). Таким образом, метаболизм эндокринных дисрапторов, осуществляемый микробиотой, может сопровождаться дисбиозом урогенитального тракта – изменением количественного и качественного состава условно-патогенных микроорганизмов, что может приводить к ухудшению качества эякулята.

Литература

1. Andrology: male reproductive health and dysfunction. Ed. by E. Nieschlag, H.M. Behre, Nieschlag S. 3rd edn. Berlin; Heidelberg: Springer-Verlag, 2010. 629 p.
2. Weng S.-L., Chiu C.-M., Lin F.-M. et al. Bacterial communities in semen from men of infertile couples: metagenomic sequencing reveals relationships of seminal microbiota to semen quality. PLoS One 2014;9(10):e110152. DOI: 10.1371/journal.pone.0110152.
3. Липова Е.В., Чекмарев А.С., Болдырева М.Н. Новый метод диагностики инфекционно-воспалительных заболеваний нижних отделов мочеполового тракта у мужчин(тест «Андрофлор®», «Андрофлор®Скрин»). М., 2017. 48 с. [Lipova E.V., Chekmarev A.S., Boldyreva M.N. New method for diagnostics of infectious-inflammatory diseases of the lower urinary tract in men(test “Agroflor®”, “Agroflor® Screen”). Moscow, 2017. 48 p. (In Russ.)].
4. Alfano M., Ferrarese R., Locatelli I. et al. Testicular microbiome in azoospermic men – first evidence of the impact of an altered microenvironment. Hum Reprod 2018;33(7):1212–7. DOI: 10.1093/humrep/dey116. PMID: 29850857.
5. Bradley P.M., Battaglin W.A., Iwanowicz L.R. et al. Aerobic biodegradation potential of endocrinedisrupting chemicals in surface-water sediment at Rocky Mountain National Park, USA. Environ Toxicol Chem 2016;35(5):1087–96. DOI: 10.1002/etc.3266. PMID: 26588039.
6. Velmurugan G., Ramprasath T., Gilles M. et al. Gut microbiota, endocrinedisrupting chemicals, and the diabetes epidemic. Trends Endocrinol Metab 2017;28(8):612–25. DOI: 10.1016/j.tem.2017.05.001. PMID: 28571659.
7. Fraczek M., Hryhorowicz M., Gaczarzewicz D. et al. Can apoptosis and necrosis coexist in ejaculated human spermatozoa during in vitro semen bacterial infection? J Assist Reprod Genet 2015;32(5):771–9. DOI: 10.1007/s10815-015-0462-x. PMID: 25808020.
8. Krzymińska S., Szczuka E., Kaznowski A. Staphylococcus haemolyticus strains target mitochondria and induce caspasedependent apoptosis of macrophages. Antonie Van Leeuwenhoek 2012;102:611–20. DOI: 10.1007/s10482-012-9756-5.
9. Lu Y., Bhushan S., Tchatalbachev S. et al. Necrosis is the dominant cell death pathway in uropathogenic Escherichia coli elicited epididymo-orchitis and is responsible for damage of rat testis. PLoS One 2013;8(1):e52919. DOI: 10.1371/journal.pone.0052919. PMID: 23301002.
10. Vitku J., Heracek J., Sosvorova L. et al. Associations of bisphenol A and polychlorinated biphenyls with spermatogenesis and steroidogenesis in two biological fluids from men attending an infertility clinic. Environ Int 2016;89–90:166–73. DOI: 10.1016/j.envint.2016.01.021. PMID: 26863184.
11. Jurewicz J., Radwan M., Wielgomas B. et al. Environmental levels of triclosan and male fertility. Environ Sci Pollut Res Int 2018;25(6):5484–90. DOI: 10.1007/s11356-017-0866-5. PMID: 29214481.
12. Чигринец С.В., Брюхин Г.В., Иленхо О.С. Влияние эндокринного дизраптора триклозана на качество эякулята у мужчин. Проблемы репродукции 2018;24(3):61–6. [Chigrinets S.V., Bryuhin G.V., Ilenkho O.S. Environmental exposure to endocrine disruptor of triclosan and semen quality of men. Problemy reproduktsii = Russian Journal of Human Reproduction 2018;24(3):61–6. (In Russ.)]. DOI: 10.17116/repro201824361.
13. WHO laboratory manual for the examination and processing of human semen. 5th edn. Geneva, 2010. 287 p. Available at: http://apps.who.int/iris/bitstream/ 10665/44261/1/9789241547789_eng.pdf.
14. Hou D., Zhou X., Zhong X. et al. Microbiota of the seminal fluid from healthy and infertile men. Fertil Steril 2013;100(5):1261–9. DOI: 10.1016/j.fertnstert.2013.07.1991. PMID: 23993888.
15. Lai K.P., Chung Y.T., Li R. et al. Bisphenol A alters gut microbiome: Comparative metagenomics analysis. Environ Pollut 2016;218:923–30. DOI: 10.1016/j.envpol.2016.08.039. PMID: 27554980.

Статья опубликована в журнале "Андрология и генитальная хирургия" выпуск №4 2018, стр. 60-66