Д. Кузьмин^1,2, Е.А. Щуплова¹

• ¹Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза УрО РАН, Оренбург, Россия
• ²Оренбургская областная клиническая больница, Оренбург, Россия

Пиелонефрит является самым частым заболеванием почек во всех возрастных группах, при­чем в 25–30% случаев течение острого пиелонефрита осложняется развитием гнойно-деструктивных форм (апостема­тозный пиелонефрит, карбункул и абсцесс почки). Частота нефрэктомий при гнойном пиелонефрите составляет 8,2–44,6% [1]. Послеоперационная летальность при этом достигает 28,4–48,5% [1, 2].

На фоне отмечающейся тенденции к уве­личению заболеваемости пиелонефритом и его септических проявлений в виде гнойно-деструктивных форм проблема адекватной диагностики поражений почек остается весь­ма актуальной [3]. Несмотря на наличие современного диагностического оборудова­ния, мощных антибактериальных средств и широких оперативных возможностей, число больных гнойными заболеваниями почек продолжает неуклонно возрастать [4].

С целью упрощения дифференциальной диагностики серозной и гнойной стадий острого пиелонефрита Л.А. Синяковой были разработаны критерии, включающие клини­ческие симптомы, результаты лабораторных исследований мочи и крови, рентгенологи­ческого и ультразвукового исследований [5]. В настоящее время широкое применение находят современные высокотехнологичные методы исследования, которые позволяют оценивать структурно-функциональное состояние почечной паренхимы на принци­пиально ином, максимально приближенном к морфологическому уровне диагностики. К ним относят УЗ-доплерографию, магнитно- резонансную томографию (МРТ), мультиспи­ральную компьютерную томографию (МСКТ) [6]. Однако, к сожалению, не всегда с полной уверенностью на основании результатов объективного осмотра и анализа лаборатор­но-инструментальных данных можно диф­ференцировать серозную и гнойную стадии острого пиелонефрита. В связи с этим нами были разработаны дополнительные микро­биологические критерии для диагностики стадий острого пиелонефрита, в частности перехода серозной в гнойную стадию.

Материалы и методы

В наших исследованиях были обсле­дованы 35 пациентов (26 женщин, 9 муж­чин) с острым пиелонефритом в возрасте от 19 до 85 лет (средний возраст 52 года). Обследование включало сбор анамнеза, выявление клинических симптомов, в т.ч. болезненности в области почек, общие анализы крови и мочи, а также рентгено­логическое и ультразвуковое исследования. Наряду с этим у всех пациентов брали кровь из локтевой вены стерильным одноразовым шприцем и переливали ее в пробирку с антикоагулянтом. Изучение образцов крови проводили с помощью классического бакте­риологического метода и молекулярно-гене­тической флуоресцентной in situ гибридиза­ции (FISH). При бактериологическом методе для идентификации гемокультур использо­вали тест-системы: Enterotest-24, Staphytest («Lachema», Чехия). При FISH использовали ДНК-зонды, комплементарные видоспеци­фическим участкам гена 16S рРНК микроор­ганизмов Oligo 1 (Enterobacteriaceaе), Oligo 3 (Staphylococcus aureus), Oligo 5 (Staphylococcus epidermidis) Oligo 6 (Staphylococcus spp.)). Данные зонды синтезировали в ООО «ДНК- синтез» (Москва) и на 5'-конце пометили флуоресцеинаизотиоцианатом (FITC). Кровь больных обрабатывали по методу, описан­ному в работе Е.А. Щупловой и соавт. [7]. Далее с помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа (КЛСМ) опреде­ляли число адгезированных на поверхности эритроцитов и внутриэритроцитарно рас­положенных бактерий.

Статистический анализ полученных результатов проводили с помощью про­граммы Statistica 6.0. Для оценки различий (р) использовали критерий (t) Стьюдента, различия считали значимыми (достовер­ными) при р<0,05.

Результаты и обсуждение

У всех 35 обследованных пациентов наблюдали гипертермию. Результаты УЗИ выявили у всех пациентов признаки остро­го пиелонефрита. В клиническом анализе крови отмечали лейкоцитоз (12,4±3,8×109/л) со сдвигом лейкоцитарной формулы влево, в анализе мочи – лейкоцитурию, бактериу­рию. Полученные клинические и лаборатор­но-инструментальные результаты явились показанием к микробиологическому иссле­дованию крови. Бактериологический метод позволил выделить гемокультуру (монокуль­туру) только у 1 (2,9%) пациента, которую с помощью биохимических тестов идентифи­цировали как Escherichia coli. К сожалению, недостатком бактериологического метода является длительность культивирования посевов мочи на питательные среды до 5–7 сут., длительное время для идентификации чистой культуры с помощью различных био­химических тестов, кроме того, известно, что эффективность бактериологического метода даже при уросепсисе составляет около 45% [6]. Однако бактериологический метод необходим при выявлении резистент­ности гемокультур к антибактериальным препаратам.

В связи с этим в наших исследованиях параллельно был использован современный молекулярно-генетический метод флуорес­центной in situ гибридизации (FISH) для обна­ружения микроорганизмов в образцах крови обследуемых больных Чувствительность данного метода составляет 95% [8], время для исследований сокращается до 8–12 часов, не требуется выделения гемокуль­туры, можно сразу использовать образец крови. Метод FISH позволяет одновременно проводить идентификацию микроорганиз­мов, т.к. ДНК и рРНК бактерий гибридизуется с ДНК-зондами, комплементарными таксон­специфическим участкам гена 16S рРНК [8].

В исследуемых образцах крови, используя метод FISH и люминесцентную микроско­пию, подсчитывали число адгезированных на поверхности эритроцитов и внутриэ­ритроцитарно расположенных бактерий. Параллельно эти же образцы крови изучали с помощью бактериологического метода для выделения гемокультур (табл. 1).

Как видно из табл. 1, метод FISH оказался более чувствительным, чем бактериологи ческий метод. С помощью бактериологи­ческого метода удалось выявить наличие гемокультуры только у 6,6±1,2% обследу­емых больных, в то время как метод FISH показал наличие гемокультур у 30±5,8% больных острым пиелонефритом.

Таблица 1. Сравнение возможности обнаружения гемокультур у больных острым пиелонефритом бактериологическим методом и методом FISH

В дальнейшем для диагностики стадий острого пиелонефрита и определения вероятности развития гнойных осложнений острого пиелонефрита с помощью метода FISH определили долю (в %) бактериальных клеток, адгезированных на поверхности эритроцитов, и внутриэритроцитарно рас­положенных бактерий с использованием данных ДНК-зондов. Полученные результа­ты сопоставили с клиническим анамнезом больных острым пиелонефритом. Результаты представлены в табл. 2.

Из представленной табл. 2 видно, что в образцах крови обследуемых больных острым пиелонефритом наблюдали све­чение как адгезированных бактерий на поверхности эритроцитов, так и внутриэ­ритроцитарное расположение, но в разном долевом соотношении.

Таблица 2. Число обнаруженных бактерий в образцах крови больных острым пиелонефритом

Результаты наших исследований пока­зали, что при адгезии бактерий к поверх­ности эритроцитов (рис. 1) в 26 раз чаще наблюдали свечение с ДНК-зондом (Oligo 1), характерного для представителей семей­ства Enterobacteriaceaе в группе пациентов с гнойной стадией острого пиелонефри­та, чем в группе с серозной стадией и в 5,3 раза чаще, чем в группе с переходной стадией, что составляло 47±5,9% против 1,8±0,7 и 8,9±3,8% соответственно (при р<0,05). Среди ДНК-зондов, характерных для стафилококков, в 34,6 раза чаще наблю­дали свечение бактерий S. aureus (Oligo 3) в группе пациентов с гнойной стадией, чем в группе с серозной и в 8,6 раза чаще, чем у пациентов с переходной стадией острого пиелонефрита, что составляло 20,8±4,1% против 2,4±4,1 и 0,6±0,2% соответственно (при р<0,05).

Необходимо отметить, что свечение бак­терий с Oligo 5 – комплементарные таксон-специфическим участкам гена S. epidermidis наблюдали в образцах крови только у паци­ентов с гнойной стадией пиелонефрита.

Аналогичные результаты оказались и при внутриэритроцитарном проникновении бактерий в образцах крови обследуемых больных (рис. 2).

Рис. 1. Адгезия S. aureus к мембране эритроцита в образце крови пациента с гнойно-деструктивной формой острого пиелонефрита
Метод флуоресцентной in situ гибридизации (FISH). Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия. Ув. 1000×

Рис. 2. Внутриэритроцитарное проникновение бактерий в образце крови пациента с гнойно-деструктивной формой острого пиелонефрита Обработка исследуемого материала методом FISH. Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия. Графики флуоресцентных сигналов: зеленый флуоресцеинизотиоцианад – бактерии. Красный сигнал – эритроциты. Ув. 1000×

Необходимо отметить, что при изучении образцов крови обследуемых пациентов с серозной и переходной стадиями пиелон­фрита (n=30) свечение от бактерий наблю­дали, но гораздо реже. Было выдвинуто предположение, что бактерии появляются в серозной стадии острого пиелонефри­та задолго до деструкции (образование гнойничковых очагов в паренхиме почки) и увеличивается их число в переходной стадии. Данные бактерии могут быть «предвестниками» перехода из сероз­ной стадии в гнойную при остром пиело- нефрите.

Далее провели статистический анализ полученных данных, результаты которого позволили получить регрессионную модель, описывающую связь между числом адге­зированных на поверхности эритроцитов и внутриэритроцитарно расположенных бактерий и развитием стадий острого пие­лонефрита.

Регрессионная модель представляет собой интегральный показатель (ИП), зна­чения которого позволили получить диапа­зоны соответствующих стадий при развитии острого пиелонефрита.

ИП рассчитывается по формуле: ИП=1,28-0,37×X1+1,35×X2,
где X1 – общее число всех адгезированных бактерий на поверхности эритроцитов в образце крови больного, обработанных зон­дами: Oligo 1, Oligo 2, Oligo 3, Oligo 5, Oligo 6, X2 – общее число всех внутриэритроцитарно расположенных бактерий в образце крови больного, обработанных зондами: Oligo 1, Oligo 2, Oligo 3, Oligo 5, Oligo 6.

По результатам значений иИП и клиниче­ски подтвержденных диагнозов получили диапазоны значений для дифференциаций стадий острого пиелонефрита, которые представлены в табл. 3.

Как видно из табл. 3, чем больше значения ИП (число адгезированных на поверхности эритроцитов и внутриэритроцитарно рас­положенных бактерий), тем больше веро­ятность развития гнойной стадии острого пиелонефрита и, соответственно, тяжелее состояние больного.

Таблица 3. Диапазоны значений для дифференциации стадий острого пиелонефрита

Таким образом, дифференциальная диа­гностика серозной и гнойной стадий острого пиелонефрита достаточна сложна. Несмотря на существующие диагностические крите­рии, далеко не всегда врач может вовремя поставить точный диагноз. По мнению З.С. Вайнберга, каждый пациент с подозрением на наличие гнойного процесса в почках «в известной степени есть кроссворд, и от умения врача находить единственно пра­вильные ответы и решения зависит жизнь пациента» [9].

Результаты данной работы показали, что при диагностике острого пиелонеф­рита имеется необходимость применения дополнительных методов для выявления микроорганизмов в кровотоке обследу­емых больных, причем для обнаружения гемокультуры более точный и быстрый по времени оказался современный молеку­лярно-генетический метод FISH. По этио­логической значимости первостепенное место занимали представители семейства Enterobacteriaceaе, на втором месте оказался S. aureus. Полученные результаты нашли под­тверждение в литературе [9], где отмечается, что при гнойном пиелонефрите основными возбудителями являются грамотрицатель­ные условно-патогенные микроорганизмы (76,9%).

Таким образом, использование современ­ного молекулярно-генетического метода флуоресцентной in situ гибридизации в диа­гностике острого пиелонефрита можно реко­мендовать как дополнительный критерий для дифференциации серозной и гнойной стадий заболевания.

Нами был получен патент на изобретение №2716713 «Способ диагностики острого пиелонефрита» (см. рис. 3).

Заключение

Одной из важных проблем в урологии считаются своевременная диагностика гнойно-деструктивного пиелонефрита и его осложнения в виде уросепсиса. Все известные методы исследований выявляют уже сформированный гнойный процесс, что объясняет поиск новых высокоспецифич­ных и чувствительных маркеров их разви­тия [4]. Результаты нашей работы показали возможность создания дополнительного диагностического критерия для дифферен­циаций пациентов с серозной и гнойной формами острого пиелонефрита. Данный способ заключается в определении числа адгезированных на поверхности эритроци­тов и внутриэритроцитарно расположен­ных бактерий, обнаруженных с помощью современного молекулярно-генетического метода флуоресцентной in situ гибриди­зации. Метод FISH позволяет обнаружить и одновременно провести идентификацию микроорганизмов, т.к. ДНК и рРНК бактерий гибридизуется с ДНК-зондами, комплементарными таксонспецифическим участкам гена 16S рРНК микроорганизмов. Другим преимуществом FISH является воз­можность проведения дифференциальной диагностики серозной и гнойной стадий острого пиелонефрита по образцам крови обследуемых больных без выделения гемокультуры.

ЛИТЕРАТУРА

1.  Лоран О.Б., Синякова Л.А., Берников Е.В. Функциональное состояние почек у больных, перенесших гной­ный пиелонефрит. Урология. 2008; 5:3–7.
2.  Плеханов В.Н. О трудностях диагности­ки гнойно-деструктивных форм острого пиелонефрита у мужчин молодого воз­раста. Вестник РУДН, серия Медицина. 2010;1:172–7.
3. Mahmood T., Puckrin R., Sugar L., Naimark D. Staphylococcus-associated glomerulonephritis mimicking henoch-schönlein purpura and cryoglobulinemic vasculitis in a patient with an epidural abscess: a case report and brief review of the literature. Canadian J. Kidney Health Dis. 2018;5:1–6.
4. Чернова Ю.Г., Неймарк А.И., Момот А.П. Роль пресепсина в оценке тяже­сти и эффективности лечения гной­ного пиелонефрита. Урология. 2018; 5:22–6.
5. Синякова Л.А. Рецидивирующие инфек­ции нижних мочевых путей: сложности упрощенной диагностики. Урология сегодня. 2013;1:18–21.
6. Аляев Ю.Г., Газимиев М.А., Еникеев Д. Современные аспекты диагностики острого пиелонефрита. Врач. 2009; 6:76–8.
7. Щуплова Е.А., Черкасов С.В., Плотников А.О. Применение метода FISH для выявления бактерий, локализован­ных на поверхности и внутри эри­троцитов. Клиническая лабора­торная диагностика. 2017;62(7): 431–5.
8. Гаврилов С.Н., Скачкова Т.С., Шипулина О.Ю., Савочкина Ю.А., Шипулин Г.А., Малеев В.В. Современные молекуляр­но-генетические методы, используе­мые для этиологической диагностики сепсиса. Журнал микробиологии, эпи­демиологии и иммунобиологии. 2016; 2:91–9.
9. Белый Л.Е. Неотложная урология: Руководство для врачей. М., 2011. 472 с.