В.Н. Павлов¹ , И.Р. Гилязова^1,2, А.А. Измайлов¹ , Е.А. Климентова² , И.Р. Султанов¹ , М.А. Бермишева² , З.Р. Ахмадеев² , А.Х. Нургалиева³ , Г.В. Ишбулатова³ , Э.К. Хуснутдинова^1,2,3

¹ ФГБОУ ВО «Башкирский государственный медицинский университет» МЗ РФ; Уфа, Россия
² Институт биохимии и генетики Уфимского федерального исследовательского центра Российской академии наук; Уфа, Россия
³ ФГБОУ ВО «Башкирский государственный университет»; Уфа, Россия

Введение

Рак почки (РП) – это гетерогенная группа злокачественных опухолей, подавляющее большинство которых представляют собой почечно-клеточные карциномы различных морфологических типов, но наиболее часто встречается светлоклеточный рак почки (СРП). Особое внимание в канцерогенезе СРП уделяется VHL-HIF1α пути. При нормоксии пролиновые остатки в HIFα гидрокислированы, что делает возможным работу VHL-комплекса и убиквитинилирование HIF1α. HIF участвует в регуляции многих биологических процессов - доставка кислорода и адаптация к его депривации, пролиферация клеток и ангиогенез (через фактор роста эндотелия сосудов (VEGF)), тромбоцитарный фактор роста β (PDGF-β) и трансформирующий рост фактор-α (TGF-α)), метастазирование через подавление E-кадгерина [1, 2]. Нарушения убиквитин-лигазного комплекса приводят к нарастанию концентрации HIF в клетках и приводит к гиперэкспрессии гипоксией-индуцируемых генов, которые участвуют в положительной регуляции клеточной пролиферации и ангиогенезе.

В настоящее время считается, что большую роль в возникновении злокачественных новообразований играют микроРНК – короткие некодирующие РНК длиной 18-25 нуклеотидов, которые взаимодействуют по комплементарному принципу с 3’-нетранслируемыми областями мРНК-мишеней. Согласно имеющимся данным, каждая микроРНК может регулировать сотни различных белок-кодирующих генов [2]. Было показано, что многочисленные гены, участвующие в патогенезе СРП, такие как VHL, PTEN, HIF1-α, mTOR, являются мишенями микроРНК [3]. Изменение характера взаимодействия микроРНК с сайтом связывания в результате однонуклеотидной замены может способствовать изменению экспрессии генов-мишеней, задействованных в возникновении и развитии опухолей.

Целью данного исследования был анализ роли отдельных полиморфных вариантов в сайтах связывания микроРНК (miRNA) генов VHL-HIF1α пути в развитии СРП.

Материалы и методы

В работе использованы 225 образцов ДНК, выделенных из венозной крови пациентов со СРП, находящихся на стационарном лечении в клинике БГМУ. Контрольная группа была сформирована из 298 здоровых неродственных жителей Республики Башкортостан, не имеющих злокачественных новообразований, которые по возрасту, полу, этнической принадлежности и территории проживания соответствовали группе больных. Средний возраст пациентов составил 56,7 года (от 24 до 84 лет на момент постановки диагноза). Забор образцов проводился сотрудниками кафедры урологии в соответствии с этическими стандартами, разработанными Хельсинской декларацией Всемирной ассоциации «Этические принципы проведения научных медицинских исследований с участием человека». У всех обследуемых лиц образцы крови были получены с их информированного согласия. Диагноз был поставлен на основании данных клинического и гистологического обследований.

Определение генотипов полиморфных локусов сайтов связывания микроРНК в генах VHL-HIFαзависимого пути (rs10982724 гена DEC1, rs406271 гена TFRC, rs10491534 гена TSC1, rs1642742 гена VHL, rs3025033 гена VEGFA) проводили методом аллельной дискриминации Taq-man на приборе CFX96 Touch™ Real-Time PCR Detection System. Результаты каждой аллельной дискриминации были проанализированы, используя программное обеспечение CFX96 Touch™ Real-Time PCR Detection System. При попарном сравнении частот генотипов и аллелей в группах больных и здоровых лиц использовался критерий χ2 (Р) для таблиц сопряженности 2х2 с поправкой Йетса на непрерывность.

Результаты

Проведён анализ полиморфных вариантов в генах VHL- HIFα-зависимого пути у пациентов со СРП и в группе здоровых индивидов. Анализ распределения частот аллелей и генотипов по полиморфным локусам rs10982724 гена DEC1, rs406271 гена TFRC, rs3025033 гена VEGFA между пациентами со СРП и здоровыми индивидами не показал каких-либо статистически значимых различий. При сравнительном анализе частот генотипов и аллелей полиморфного локуса rs1642742 гена VHL было показано, что генотип rs1642742*AA(p=0,0165; OR= 0,5978; 95% CI (0,3915- 0,9213)) встречался у пациентов со СРП в возрасте 55 лет и старше значительно реже, чем в контрольной группе той же возрастной категории, тогда как генотип rs1642742*GG чаще встречался у пациентов, являясь маркёром повышенного риска развития СРП (табл. 1).

Таблица 1. Распределение генотипов и аллелей полиморфного локуса rs1642742 гена VHL в группе пациентов со СРП

Кроме того, проведён анализ полиморфного локуса rs10491534 гена TSC1. TSC1 – ген, кодирующий белок туберозного склероза гамартин – ключевой интегратор сигналинга ростовых факторов. Белок TSC1 подавляет рост и пролиферацию клеток, ингибируя мишень комплекс рапамицина 1 в клетках млекопитающих.

При сравнении группы больных с учётом тяжести течения заболевания были выявлены статистически значимые различия в распределении частот аллелей и генотипов полиморфного локуса rs10491534 гена TSC1 (табл. 2).

Таблица 2. Распределение генотипов и аллелей полиморфного локуса rs10491534 гена TSC1 в группе пациентов со СРП тяжёлого течения и в контроле

Обсуждение

В результате проведённого анализа наиболее значимые ассоциации были выявлены для полиморфных локусов, расположенных в генах VHL и TSC1. Одним из важных генов-супрессоров опухолевого роста, инактивируемых при светлоклеточном раке почки (СРП) является ген фон Хиппеля-Линдау (VHL, von Hippel–Lindau), локализованный на коротком плече хромосомы 3 в области 3p25-3p26. Основной функцией белка VHL является регуляция индуцируемого гипоксией фактора α (HIF-1α) путём образования комплекса, обладающего E3 -убиквитин-лигазной активностью. Moore L.E. et al. показали, что полиморфный вариант rs1642742 гена VHL был связан с риском гиперметилирования VHL-промотора [4]. Случаи СРП с конкретными полиморфизмами зародышевой линии VHL с большей вероятностью имели инактивацию VHL посредством гиперметилирования промотора, чем путем изменения последовательности ДНК в опухолевой ткани. Таким образом, можно предположить, что присутствие этих SNP может представлять собой пример облегченной эпигенетической вариации (унаследованной склонности к эпигенетической вариации) в ткани почки. Мы показали значительно повышенный риск развития СРП у носителей аллеля rs1642742*G в возрасте 55 лет и старше. Такие же результаты были представлены в исследовании Wen-Chung Wang et al., где частота аллеля G в rs1642742 была намного выше при поздних стадиях карциномы почек у пациентов из Тайваня [5].

Гены туберозного склероза TSC1 и TSC2 действуют совместно для ингибирования сигнального пути mTOR. Этот универсальный для многих клеток организма путь отвечает за процессы клеточного роста, пролиферации, дифференциации, обладая онкогенной активностью. Известно, что нарушения пути mTOR путём гиперэкспрессии или структурных нарушений генов, входящих в сигнальный путь, может приводить к злокачественной трансформации клеток [6]. В исследовании Wei H et al. не было показано статистически значимых ассоциаций полиморфного варианта rs10491534 с риском развития СРП [2]. Также было показано, что полиморфный вариант rs10491534 гена TSC1 играет важную роль в модулировании риска развития вторичных опухолей / рецидивов [7].

Выводы

Полученные в результате настоящего исследования данные свидетельствуют об ассоциации полиморфных вариантов сайтов связывания микроРНК с риском развития рака почки, а также тяжестью течения заболевания. Вместе с другими известными эпидемиологическими, клиническими и генетическими факторами выявленные генетические маркёры могут способствовать выявлению лиц с высоким риском развития рака почки тяжёлого течения. Однако, необходимы дальнейшие исследования изученных генов на независимых выборках для установления их функциональной значимости и роли в патогенезе злокачественных новообразований почки.

Литература

1. Zhang J, Zhang Q. VHL and Hypoxia Signaling: Beyond HIF in Cancer. Biomedicines. 2018;6(1),35. DOI: 10.3390/biomedicines6010035
2. Wei H, Ke H-L, Lin J, Shete S, Wood CG, Hildebrandt MA. MiRNA target site polymorphisms in the VHL-HIF1α pathway predict renal cell carcinoma risk. Molecular carcinogenesis. 2014;53(1):1-7. DOI: 10.1002/mc.21917
3. Chow TF, Youssef YM, Lianidou E, Romaschin AD, Honey RJ, Stewart R, Pace KT, Yousef GM. Diff erential expression profi ling of miRNAs and their potential involvement in renal cell carcinoma pathogenesis. Clinical Biochemistry. 2010;43(1- 2):150-158. DOI: 10.1016/j.clinbiochem.2009.07.020
4. Moore LE, Nickerson ML, Brennan P, Toro JR, Jaeger E, Rinsky J, Han SS, Zaridze D, Matveev V, Janout V, Kollarova H, Bencko V, Navratilova M, Szeszenia-Dabrowska N, Mates D, Schmidt LS, Lenz P, Karami S, Linehan WM, Merino M, Chanock S, Boff eƩ a P, Chow WH, Waldman FM, Rothman N. Von Hippel-Lindau (VHL) Inactivation in Sporadic Clear Cell Renal Cancer: Associations with Germline VHL Polymorphisms and Etiologic Risk Factors. PLОS Genet. 2011;7(10):e1002312. DOI: 10.1371/journal.pgen.1002312
5. Wang WC, Tsou MH, Chen HJ, Hsu WF, Lai YC. Two single nucleotide polymorphism sinthe von Hippel-Lindau tumor suppressor gene in Taiwanese with renal cell carcinoma. BMC Research Notes. 2014;7:638. DOI: 10.1186/1756-0500- 7-638
6. Mehta MS, Vazquez A, Kulkarni DA, Kerrigan JE, Atwal G, Metsugi S, Toppmeyer DL, Levine AJ, Hirshfi eld KM. Polymorphic variants in TSC1 and TSC2 and their association with breast cancer phenotypes. Breast cancer research and treatment. 2011;125(3):861-868. DOI: 10.1007/s10549- 010-1062-1.
7. Hildebrandt MAT, Lippman SM, Etzel CJ, Kim E, Lee JJ, Khuri FR, Spitz MR, Lotan R, Hong WK, Wu X. Genetic variants in the PI3K/PTEN/AKT/MTOR pathway predict head and neck cancer patient second primary tumor/recurrence risk and response to retinoid chemoprevention. Clinical Cancer Research. 2012;18(13):3705-3713. DOI: 10.1158/1078- 0432.CCR-11-3271

Статья опубликована в журнале "Вестник урологии" № 4 2018, стр. 36-41