Жидкостная биопсия с выявлением внеклеточной опухолевой ДНК в диагностике РМП

Марк Джайн
Аспирант кафедры многопрофильной клинической подготовки ФФММГУ, стажер-исследователь отдела лабораторной диагностики «МНОЦ МГУ имени М.В. Ломоносова», Москва

Термин «жидкостная биопсия» объединяет современные высокотехнологичные методики для выявления дериватов опухолей в жидкостях нашего организма. Дериваты в данном случае – не типичные биомаркеры, а компоненты, продуцируемые опухолью. Поэтому предполагается, что у этих методов отсутствуют ложноположительные результаты.

В качестве субстратов жидкостной биопсии рассматриваются кровь, моча, применимые при любом онкологическом заболевании; ликвор при глиомах; желчь при раке поджелудочной железы, желчного пузыря, желчных протоков.

Мишени жидкостной биопсии.

• Внеклеточная ДНК. Опухолевый компонент определяется по наличию мутаций, характерных для заболевания; по измененным паттернам метилирования; по физическим свойствам, например по размеру фрагментов.
• Некодирующие РНК: микроРНК, малые интерферирующие РНК. Опухоль использует РНК для перепрограммирования соседних клеток и для инвазий.
• Экзосомы. Могут нести поверхностные маркеры, микроРНК, нуклеиновые кислоты.
• Циркулирующие опухолевые клетки были изучены первыми. Эти клетки отличаются по наличию поверхностных маркеров, по физическим свойствам. Лектор отметил, что дериваты используются для анализа, когда речь идет о поздних стадиях заболевания.
• Обученные опухолью тромбоциты – самая современная мишень. Это тромбоциты, которые опухоль перепрограммировала для помощи в осуществлении инвазии. 

Анализ нуклеиновых кислот в моче

При раке мочевого пузыря в первую очередь рассматривается анализ нуклеиновых кислот в моче. При продолжительном контакте мочи с опухолью в составе мочи появляются компоненты опухоли, даже сами опухолевые клетки, клеточные и внеклеточные нуклеиновые кислоты. Как правило, в моче отсутствуют ферменты, уничтожающие нуклеиновые кислоты. У опухоли мочевого пузыря – консервативный генотип, то есть анализу подвергаются большое число распространенных мутаций. Анализировать нуклеиновые опухолевые кислоты в моче несложно, поскольку требований к оснащению лабораторий меньше, пробоподготовка простая.

Джайн Марк обозначил два основных источника внеклеточных нуклеиновых кислот. Ранее источником считалась только гибель клеток вследствие апоптоза и некроза, однако стало известно, что большее значение имеет активная секреция. Опухоль намеренно вырабатывает нуклеиновые кислоты. В экспериментах на клеточных культурах показана слабая ассоциация уровня внеклеточных НК с апоптозом.

Основные подходы к выявлению опухолевых нуклеиновых кислот в моче

• Метилирование ДНК. Обладает высокой чувствительностью.
  При проведении данного анализа пробоподготовка агрессивна и приводит к деградации ДНК. Изменения в паттернах метилирования не носят абсолютный характер, так как встречаются и в здоровых клетках.
• МикроРНК. РНК крайне уязвимы к наличию РНКаз в растворе. Поэтому специфичность – обратная доля ложноположительных результатов, так же как и при метилировании ДНК, не достигает 100%.
• Анализ мутаций ДНК обладает крайне высокими аналитическими характеристиками. Это связано с тем, что мутации присутствуют только в опухолевых клетках. Стоит отметить, что для достижения высокой чувствительности необходимы дорогостоящие методы анализа. «Hotspot» мутации включают две категории: кодирующие мутации, влияющие на структуру белка, и некодирующие, которые влияют на экспрессию генов. Некодирующие мутации тяжело анализировать. Лектор продемонстрировал это на примере недавно открытой мутации GPR126. Несмотря на сложности определения, был произведен первый набор реагентов для детекции новых мутаций GPR126, которые были валидированы на синтетических конструкциях ДНК, имитирующих опухоль. Подтверждение получено в ходе клинического исследования, в котором участвовали 70 пациентов с мышечно-инвазивным раком и 72 пациента в группе контроля. Исследование проводилось методом цифровой капельной ПЦР, анализировались мутации в моче. Оказалось, что одни только эти мутации встречаются в моче у 36% пациентов и отсутствуют в группе контроля. Разница между стадиями заболевания во фракции мутантного аллеля отсутствовала. Это говорит о том, что изучаемые мутации являются ранним событием в туморогенезе и могут сигнализировать о наличии рака задолго до клинических проявлений.

При использовании расширенной диагностической панели частота ложноположительных результатов стремится к нулю. Стоит отметить, что этот метод может использоваться не только для диагностики рака, но и для генотипирования опухоли, например для определения прогноза.

Сравнивая методы выявления мутаций – цифровую ПЦР и секвенирование нового поколения, лектор отмечает, что количество мишеней жидкостной биопсии для определения в цифровой ПЦР ограничено, в отличие от секвенирования, где количество мишеней может быть бесконечным. Однако не стоит сопоставлять методы, так как возможно одновременное применение, например, в мониторинге рецидивов. С помощью метода секвенирования возможно установить, какие мутации присутствуют в вырезанной опухоли и какие из них имеют самую высокую фракцию мутантного аллеля. Затем подобрать персонализированные реагенты на эту мутацию и анализировать при помощи простого и бюджетного варианта – цифровой ПЦР. Повторное появление в моче опухолевой ДНК после операции говорит о наличии рецидива.

Также Джайн Марк отмечает, что методы цифровой ПЦР и секвенирование нового поколения позволяют выявить заболевание за 10 лет до клинической манифестации. Это подтверждено исследователями из Франции, которые провели биобанкирование мочи у 50 тыс. лиц в возрасте от 40 до 75 лет. Спустя 10 лет у 38 пациентов развился рак мочевого пузыря. Исследователи запросили образцы мочи и выполнили жидкостную биопсию по мутациям в промоторе Tert, после чего была обнаружена опухолевая ДНК у 14 пациентов из 38 в период от года до 10,5 лет до клинической манифестации. Уникальный результат исследования подчеркивает высокий потенциал технологии анализа мутаций ДНК в моче.

Материал подготовила Болдырева Ю.Г