© В. Н. Ткачук, А. С. Аль-Шукри, Д. И. Данильченко

Кафедра урологии Санкт-Петербургского государственного медицинского университета имени акад. И. П. Павлова

Целью работы явилось изучение влияния глубины и степени дифференцировки опухолевого процесса на уровень матрикс-металлопротеаз 2 и 9 в моче у больных раком мочевого пузыря. Пациенты и методы. Обследовали 71 больного раком мочевого пузыря. Группу сравнения составили 14 больных хроническим циститом, а контрольную группу — 45 больных, не имеющих болезней мочевого пузыря, обструкции и инфекции мочевыводящих путей. Уровень металлопротеаз определяли методом цимографии. Результаты. Доказано, что ферменты протеолиза мочи ММП-2 и ММП-9 являются высокочувствительными показателями наличия рака мочевого пузыря, а их концентрация зависит от глубины инвазии и степени дифференцировки опухоли и указывает на прогноз течения болезни. Заключение. Для диагностики и неинвазивного определения глубины инвазии и степени дифференцировки рака мочевого пузыря целесообразно методом цимографии определять ММП-2 и ММП-9 в моче.

Ключевые слова: рак мочевого пузыря; матрикс-металлопротеаза.

Введение

Рак мочевого пузыря (РМП) составляет 70 % от всех опухолей мочевой системы [2]. Это заболевание наносит обществу значительный социальноэкономический ущерб [1, 3], поэтому своевременное распознавание и правильно выбранное лечение РМП с учетом определения прогноза заболевания являются актуальной проблемой современной медицины.

Для разработки новых высокоэффективных методов определения прогноза РМП необходимо более детальное и глубокое изучение биологических особенностей этого вида опухоли. Одним из новых методов оценки агрессивности опухолей в настоящее время является определение эндогенных ферментов протеолиза. В последние годы доказано, что в процессе инвазии злокачественных новообразований происходит протеолитическое разрушение базальной мембраны слизистой оболочки мочевого пузыря опухолевыми клетками [7]. К эндогенным ферментам, участвующим в этом процессе, относят матрикс-металлопротеазы (ММП), повышение концентрации которых связано с инвазией и метастазированием опухоли [4, 5, 6]. Однако опубликованные данные о прогностическом значении ММП у больных РМП являются противоречивыми.

Цель исследования

Изучение влияния активности опухолевого процесса (глубины инвазии и степени дифференцировки опухоли) на уровень матрикс-металлопротеаз 2 и 9 в моче у больных раком мочевого пузыря.

Пациенты и методы

Мы обследовали 71 больного раком мочевого пузыря, среди которых было 36 женщин и 35 мужчин в возрасте от 38 до 83 лет. Средний возраст пациентов составил 63,2 ± 5,5 лет. Больные предъявляли жалобы на учащенное (68 чел.) и болезненное (61 чел.) мочеиспускание и тупые боли над лобком (40 чел.) У 28 (39,4 %) пациентов был диагностирован рак мочевого пузыря в стадии Та (папиллярная неинвазивная карцинома), у 15 (21,1 %) — в стадии Т1 (опухоль распространялась на субэпителиальную соединительную ткань), у 18 (25,3 %) — в стадии Т2 (опухоль распространялась на мышцы) и у 10 (14,1 %) — в стадиях Т3 и Т4 (опухоль распространялась на околопузырные ткани и органы).

По степени дифференцировки опухоли, у 11 (15,5 %) больных была установлена высокая степень дифференцировки (G-1), у 27 (38,0 %) — умеренная степень дифференцировки (G-2), а у 33 (46,5 %) — низкая степень дифференцировки (G-3). У всех больных патоморфологический диагноз был определен или после трансуретральной резекции опухоли мочевого пузыря с выполнением биопсии или после цистэктомии.

В группу сравнения были включены 14 больных (6 женщин и 8 мужчин) с другим заболеванием мочевого пузыря — хроническим циститом в стадии обострения. Контрольную группу из 45 человек (4 женщины и 41 мужчина) составили пациенты, у которых не были диагностированы болезни мочевого пузыря, а они лечились в клинике урологии по поводу варикоцеле, водянки оболочек яичка, фимоза, мочекаменной болезни, но без наличия обструкции или инфекции мочевыводящих путей.

У всех пациентов в моче определяли концентрацию ММП-2 и ММП-9 по стандартной методике, описанной в работах S. Zucker и соавт. [8]. Для этого утреннюю порцию мочи центрифугировали в течение 10 мин при температуре +4 °С со скоростью 3000 об./мин. Надосадочную жидкость замораживали при температуре –80 °С до момента исследования. Концентрацию ММП-2 и ММП-9 в моче определяли при помощи цимографии, применяя при этом электрофорез в геле в течение 3 часов с 10%-м раствором SodiumDodecylsulfat-Poliacrylamid (SDP). Электрофорезом разделяли белки в зависимости от их молекулярного веса. Гель освобождали от SDP, отмывая его в течение 2 часов в буфере, а затем окрашивали его 0,2%-м раствором Coomassie-blau и сканировали на аппарате Scanmaker-4 (США). По оптической плотности геля судили о концентрации матрикс-металлопротеаз. В каждом образце геля для сравнения создавали калибровочную кривую со стандартным набором ММП-2 и ММП-9 с учетом их молекулярного веса (для ММП-2 — 72 кДа, для ММП-9 — 92 кДа).

Полученные относительные показания ММП сопоставляли с концентрацией креатинина в моче для устранения разницы диуреза пациентов [8]. В результате были получены абсолютные значения ММП-2 и ММП-9 мочи, необходимые для дальнейшего сравнения по группам.

Статистический анализ проводили с помощью программы Statistika-6,0.

Результаты

Оказалось, что у больных раком мочевого пузыря концентрация ММП-2 и ММП-9 в моче была значительно выше, чем у больных, страдающих хроническим циститом, и у лиц контрольной группы. Так, у больных раком мочевого пузыря концентрация ММП-2 в моче составила 278,7 ± 29,6 μg/g креатинина, тогда как у пациентов, страдающих хроническим циститом в стадии обострения — 101,5 ± 18,8 μg/g креатинина (р < 0,01), а у лиц контрольной группы — 83,5 ± 5,6 μg/g креатинина (р < 0,001). Содержание ММП-9 в моче у больных раком мочевого пузыря составило 405,4 ± 32,7 μg/g креатинина, тогда как у пациентов с хроническим циститом — 130,0 ± 50,7 μg/g креатинина (р < 0,01), а у лиц контрольной группы — 92,1 ± 7,7 μg/g креатинина (р < 0,001).

Концентрация ММП-2 и ММП-9 в моче в подгруппе больных с инвазивным раком мочевого пузыря (Т2) была выше (887,4 ± 41,4 μg/g креатинина и 1050,8 ± 34,8 μg/g креатинина соответственно), чем у пациентов с поверхностным раком мочевого пузыря (Та и T1), у которых она составила 153,2 ± 32,1 μg/g креатинина и 229,8 ± 24,5 μg/g креатинина (р < 0,001).

При анализе уровня ММП-2 и ММП-9 в моче у больных РМП в зависимости от степени дифференцировки опухолевых клеток оказалось, что с повышением степени злокачественности опухолевого процесса возрастает уровень исследуемых протеаз. При G-1 концентрация ММП-2 в моче составила 112,4 ± 8,8 μg/g креатинина, при G-2 — 198,6 ± 12,0 μg/g креатинина (р < 0,05), а при G-3 — 493,1 ± 18,4 μg/g креатинина (р < 0,001).

Концентрация ММП-9 у больных РМП с дифференцировкой клеток G-1 составила 232,8 ± 12,8 ug/g креатинина, при G-2 272,7 ± 31,3 μg/g креатинина (р < 0,05), а при G-3 554,3 ± 28,6 μg/g креатинина (р < 0,001).

Обсуждение

Для выявления РМП и определения прогноза заболевания оценка пролиферативной активности опухоли путем определения уровня матриксметаллопротеаз в моче является перспективным методом исследования. Этот метод позволяет урологу заподозрить или исключить РМП уже на этапе предварительного амбулаторного обследования.

Преимущество определения концентрации ММП-2 и ММП-9 в моче методом цимографии по сравнению со стандартной цистоскопией и биопсией стенок мочевого пузыря состоит в том, что это исследование является абсолютно неинвазивным, но достаточно информативным не только для диагностики рака мочевого пузыря, но и для определения глубины прорастания опухоли и дифференцировки клеток опухоли. Повышение концентрации ММП-2 и ММП-9 в моче выше 500 μg/g креатинина является сигналом о наличии у больного инвазивной стадии (Т2 и более) рака мочевого пузыря с низкой степенью дифференцировки (G-3) опухоли.

Это исследование позволяет врачу правильно планировать объем дальнейшего обследования больного, выбрать метод его лечения и более точно прогнозировать течение заболевания. Кроме того, это исследование позволяет своевременно диагностировать рецидив опухоли мочевого пузыря после проведенного лечения.

Заключение

Ферменты протеолиза ММП-2 и ММП-9 мочи являются эффективными высокочувствительными показателями наличия рака мочевого пузыря, их концентрация зависит от глубины инвазии и степени дифференцировки опухоли и указывает на прогноз течения болезни.

Для диагностики и неинвазивного определения глубины инвазии и степени дифференцировки рака мочевого пузыря целесообразно методом цимографии определять концентрацию ММП-2 и ММП-9 в моче, что позволит неинвазивным способом определить стадию рака и проводить контроль после проведенного лечения за возможным рецидивированием опухоли.

Список литературы

1. Аполихин О. И., Какорина Е. П., Сивков А. В. и др. Состояние урологической заболеваемости в Российской Федерации по данным официальной статистики // Урология. 2003. Т. 3. C. 3–9.

2. Давыдов М. И., Аксель Е. М. Статистика злокачественных новообразований в России и странах СНГ в 2004 году // Вестн. РОНЦ им. Блохина РАМН. 2006. Т. 17 (3). C. 52–89.

3. Лопаткин Н. А., Даренков С. П., Чернышов И. В. и др. Диагностика и лечение рака мочевого пузыря // Урология. 2004. Т. 1. C. 12–17.

4. Forsyth P. A., Wong H., Laing T. D. et al. Gelatinase-A (MMP-2), gelatinase-B (MMP-9) and membrane type matrix metalloproteinase-1 are involved in different aspects of the pathophysiology of different aspects of malignant gliomas // Brit. J. Cancer. 1999. Vol. 79. P. 1828–1835.

5. Kanayama H., Yokota K., Kurokawa Y. Prognostic values of matrix metalloproteinase-2 and tissue inhibitor of metalloproteinase-2 expression in bladder cancer // Cancer. 1998. Vol. 82. P. 1359–1366.

6. Sier C. F., Casetta G., Verheijen J. H. et al. Enhanced urinary gelatinase activities (matrix metalloproteinases 2 and 9) are associated with early-stage bladder carcinoma: a comparison with clinically used tumor markers // Clin. Cancer Res. 2000. Vol. 6. P. 2333–2340.

7. Stetler-Stevenson W. G., Hewitt R., Corcoran М. Matrix metalloproteinases and tumor invasion: from correlation and causality to the clinic // Semin Cancer Bil. 1996. Vol. 7. P. 1147–1154.

8. Zucker S., Lysik R., Zarrabi H. et al. Plasma assay of gelatinase B: tissue inhibitor of metailoprotemase complexes in cancer // Cancer. 1995. Vol. 76. P. 700–708.

An importance of matrix-metalloprotease determination in urine of patients with bladder cancer

Tkachuk V. N., Al-Shukri A. S., Danilchenko D. I.

Summary. The aim of this work is to estimate an influence of a depth and an extent of differentiation of neoplastic process on 2 and 9 matrix-metalloprotease levels in urine of patients with bladder cancer. Patients and methods. 71 patients with bladder cancer have been investigated. 14 patients with chronic cystitis were included in an experimental group and 45 patients without bladder diseases were included in a control group, patients without urinary tract obstructions and infections were included in a control group. A level of metalloprotease was identified by a cimographic method. Results. It has been proved that enzymes MMP-2 and MMP-9 of urine proteolysis are high sensitive markers of bladder cancer occurrence and their concentration depends on a depth of invasion and an extent of tumor differentiation, and shows a disease course prognosis. Conclusion. It is reasonably to identify MMP-2 and MMP-9 of urine by the cimographic method for diagnostics and noninvasive determination of a depth of invasion and an extent of bladder cancer differentiation.

Key words: bladder cancer; matrix-metalloprotease.