Н.В. Орлова1, А.Н. Муравьев1,4, Т.И. Виноградова1, Н.М. Юдинцева2, Ю.А. Нащекина2, Н.В. Заболотных1, А.А. Лебедев1, М.Г. Шейхов1, П.К. Яблонский1,3
Пациенты с так называемым малым мочевым пузырем (МП) составляют наиболее тяжелый контингент среди больных, страдающих заболеваниями мочеполовой системы, в том числе и туберкулезом [1,2].
Практически всем этим больным требуется реконструктивно-восстановительная хирургическая помощь. В то же время на сегодняшний день множество проблем, связанных с реконструктивной хирургией МП, остаются нерешенными [3]. По всему миру для замещения нефункционирующего МП, при неэффективности консервативных методов лечения, используют фрагменты желудочно-кишечного тракта, что нередко приводит к ряду осложнений [4,5]. Однако использование кишечной ткани уже более ста лет остается золотым стандартом в реконструкции мочевых путей. Очевидно, что найти подходящую замену ткани МП с ее уникальными свойствами совсем не просто.
Тканевая инженерия занимает важное место среди со-временных научных тенденций и подразумевает разработку подходов для реконструкции или замещения поврежденных тканей с использованием клеток и скаффолдов. Однако в структуре общего объема публикаций по данной теме урологические аспекты освещены весьма скудно.
В последние годы для лечения поврежденных органов и тканей человека широкое практическое применение находят синтетические биорезорбируемые полимерные мате-риалы, которые используют в качестве скаффолдов для культивирования клеток. Скаффолды должны обладать следующими свойствами: механическая прочность, нетоксичность (в том числе и продуктов их деградации), способствовать росту клеток, при этом скорость деградации материала и восстановления поврежденной ткани должны быть сопоставимы [6,7].
Зарубежными учеными опубликованы успешные попытки создания тканевых аналогов стенки МП, применение «биоинженерных тканей» для трансплантации опробовано в экспериментальных условиях [8]. In vivo предпринят удачный опыт замещения МП у 14 собак выращенным in vitro неоцистисом [9]. После удачного эксперимента на лабораторных животных сгенерированный in vitro резервуар успешно трансплантирован человеку [10].
Однако исследователи в качестве источника клеток использовали собственные ткани МП, что невозможно в случаях замещения всех тканей мочевого пузыря рубцовыми, когда практически отсутствуют здоровый уротелий и мышечная стенка. Наши исследования направлены на поиск возможности применения клеточных технологий для помощи именно таким пациентам, имеющим малый МП, в том числе и туберкулезной этиологии [11].
Известно, что некоторые клетки организма не обладают выраженной иммуногенностью, и подходят для аллогенной трансплантации. Из всего многообразия клеточных источников хочется выделить группу мезенхимальных стволовых клеток (МСК). In vitro доказана способность МСК дифференцироваться в клетки, обладающие свойствами гладких миоцитов, уротелиальных и эндотелиальных клеток. Поэтому они являются весьма заманчивым кандидатом для реконструкции мочевого пузыря [12]. Мезенхимальные стволовые клетки обладают способностью воздействовать на иммунный ответ, снижая выраженность реакции на имплант [13].
За последний год опубликованы результаты системной терапии МСК при различных заболеваниях [14,15] и экспериментальных работ по реконструкции различных урологических структур. Мировой опыт применения аллогенных МСК для реконструкции МП на сегодняшний день представ-лен всего несколькими экспериментальными исследованиями [16-20].
Цель. Изучение возможности применения многокомпонентного трансплантата с использованием аллогенных мезенхимальных стволовых клеток красного костного мозга для замещения дефекта стенки МП в экспериментальных условиях.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Исследование выполнено на взрослом кролике-самце породы «шиншилла» (питомник «Рапполово» РАМН, Санкт-Петербург). МСК кролика выделены по стандартной методике после забора красного костного мозга из гребня подвздошной кости кролика (рис. 1) [21]. Клетки мечены железосодержащими наночастицами.
Рис. 1. Морфология мезенхимальных стволовых клеток ( х100)
Fig. 1. Morphology of mesenchymal stem cells (x100)
В качестве материала для приготовления скаффолда использован полимер на основе молочной кислоты – поли-L,L-лактид. Внешний вид матрицы представлен на рисунке 2а. Гидрофобный характер полилактида и отсутствие специфических сайтов связывания с рецепторами клеток существенно ограничивает использование его для культивирования и трансплантации клеток. Оказалось, что с этой проблемой можно справиться, заполнив матрицу гелем на основе коллагена I типа (рис. 2б).
После культивирования необходимого количества МСК приготовлен трансплантат на основе полилактидной матрицы, заселенной мечеными клетками в составе коллагенового геля, который трансплантирован in vivo после парциальной резекции МП кролика.
Анестезиологическое пособие включало: комбинированный препарат для анестезии тилетамина гидрохлорид/ золазепама гидрохлорид (золетил) в дозе 25 мг/кг массы тела внутривенно в краевую ушную вену; миорелаксант ксилазина гидрохлорид (рометар) в виде 2% раствора внутримышечно в объеме 1,0-1,5 мл. Под общей анестезией МП кролика выведен в рану через срединный лапаротомический разрез длиной 4 см. По передней стенке МП частично отсепарована паравезикальная клетчатка, выполнена резекция фрагмента стенки пузыря 2,0х2,0см (рис. 3а). Приготовленный многокомпонентный трансплантат фиксирован к стенке МП узловыми швами викрил 4-0 (рис. 3б), снаружи анастомоз укреплен отсепарованной около-пузырной клетчаткой (рис. 3в). Деривация мочи осуществлена цистостомическим дренажом (подключичный венозный катетер), проведенным под кожей на спину. Рана ушита послойно.
Рис. 2. Матрица на основе поли-L,L-лактида А – Внешний вид матрицы; Б – Матрица, заселенная клетками
Fig. 2. A matrix based on poly-L, L-lactide А – The view of the matrix; Б – Cell populated matrix
Рис. 3. Замещение дефекта мочевого пузыря А – Мочевой пузырь кролика после резекции фрагмента; Б – Закрытие дефекта заселенным клетками скаффолдом; В – Внешний вид мочевого пузыря
Fig.3. Bladder defect replacement А – Rabbit bladder after fragment resection; Б – Closure of the defect with a cell-infested scaffold; В – The view of the bladder
Период наблюдения составил 2,5 месяца, в течение которого еженедельно проводился мониторинг массы тела животного, также выполнялись клинический и биохимический анализы крови и общий анализ мочи, изучалось кислотно-основное состояние крови. В конце периода наблюдения выполнена магнитно-резонансная томография.
Животное выведено из эксперимента с использованием препаратов тилетамина гидрохлорид/золазепама гидрохлорид (золетил) и ксилазина гидрохлорид (рометар) в дозах троекратно превышающих терапевтическую.
Исследования проводили в соответствии с этическими принципами обращения с лабораторными животными «Eu-ropean Convention for the Protection of Vertebral Animals Used for Experimental and Other Scientific Purposes. CETS No. 123» и Правилами лабораторной практики (Приказ Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации от 23 августа 2010 г. № 708н «Об утверждении Правил лабораторной практики»).
РЕЗУЛЬТАТЫ
Животное перенесло операцию хорошо. Рана зажила первичным натяжением. Катетер удален на 14-е сутки. За период наблюдения в анализах крови и мочи не зафиксировано патологических сдвигов, также отмечался адекватный прирост массы тела кролика.
На серии магнитно-резонансных томограмм виден заполненный мочевой пузырь нормальной емкости (рис. 4).
Рис. 4. Мочевой пузырь кролика при магнитно-резонансной томографии
Fig. 4. Magnetic resonance imaging of rabbit's bladder
Рис. 5. Макроскопическое исследование. Внутренняя поверхность мочевого пузыря кролика
Fig. 5. Macroscopic examination. The inner surface of the rabbit bladder
В месте имплантации визуализируется наводящий артефакт от введенных в клетки железосодержащих меток.
При макроскопическом осмотре патологических изменений со стороны внутренних органов не выявлено: паренхиматозные органы визуально не изменены, спаечный процесс и патологический выпот в брюшной полости отсутствовали, внутрибрюшные лимфатические узлы визуально не увеличены.
Следует отметить также отсутствие явлений отторжения трансплантата и признаки васкуляризации пересаженного лоскута (рис. 5).
При конфокальной микроскопии криосрезов в месте имплантации определяются меченые клетки, принимающие участие в формировании структуры, сходной с уротелием (рис. 6).
Рис. 6. Место имплантации при конфокальной микроскопии криосреза, х40
Fig.6. Place of implantation under confocal microscopy of cryosection, x40
ОБСУЖДЕНИЕ
Идея использования мезенхимальных стволовых клеток для формирования тканеинженерных конструкций рассматривается многими ведущими российскими и зарубежными исследователями. В результате проведенного нами экспериментального исследования разработан аллогенный тканеинженерный продукт, который может применяться для хирургического восстановления дефекта мочевого пузыря. Показана принципиальная возможность трансплантации искусственных тканеподобных субстанций аллогенной природы.
Полученные положительные результаты создают предпосылки для дальнейшей разработки и создания многокомпонентного трансплантата с использованием алло-генных клеток, что, возможно, будет способствовать улучшению результатов лечения патологических состояний, при которых получение аутологичного материала не представляется возможным.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Проведенный эксперимент в очередной раз показывает необходимость дальнейших исследований в области реконструкции стенки МП. Однако вопрос возможности применения МСК в клинической практике пока остается открытым, уникальные свойства этих клеток до сих пор полностью не изучены и представляют собой огромный научный интерес. Полного понимания механизмов, отвечающих за их
защитные и регенеративные эффекты, пока не достигнуто. Полученные на сегодняшний день результаты хотя и являются обнадеживающими, но требуют более детального изучения.
ЛИТЕРАТУРА
Статья опубликована в журнале "Экспериментальная и клиническая урология" №4 2019, стр. 26-30
Комментарии