Ильинских Н.Н., Ильинских Е.Н., Тагаев А.В.

Морфологические изменения сперматозодов являются результатом сложных внутриклеточных процессов во время сперматогенеза, когда из диплоидной клетки в результате последовательных делений образуются гаплоидные сперматиды и после трансформации ядра и органоидов, формируется зрелый сперматозоид [1]. Регистрируемый уровень аномальных сперматозоидов может служить индикатором наличия дефектного механизма, связанного с процессом созревания сперматозоидов [2]. Кроме того, морфология сперматозоидов является классической характеристикой параметров качества спермы, а ее изменения служат маркером генетических повреждений молекулярных структур ядер клеток организма [2,3]. Известно что, около 15% супружеских пар страдает бесплодием, причем треть случаев обусловлена мужским бесплодием [4]. Имеются многочисленные исследования, посвященные патологическим изменениям сперматозоидов в связи с мужским бесплодием. Приводятся самые разнообразные причины образования патологических изменений сперматозоидов: фрагментация ДНК, оксидативный стресс, апоптоз, что по мнению некоторых ученых, в основном связано с загрязнением условий окружающей среды факторами мутагенной природы [1,5]. Ранее нами было установлено, что у вахтовых рабочих-нефтяников на севере Сибири значимо возрастает число соматических клеток буккального и урогенитального эпителия, лимфоцитов крови с цитогенетическими нарушениями, что мы склонны были считать следствием влияния на рабочего-нефтяника углеводородов с генотоксическими эффектами [6]. Закономерно возникает предположение, что генеративные клетки у рабочего-нефтяника так же подвержены генотоксическим воздействиям. Наши исследования показали, что цитогенетические изменения в соматических клетках у рабочих-нефтяников зависят от присутствия в их генотипе мутационных аллелей генов глутатионS-трансферазы – GSTM1 и GSTT1 [7]. A.C. Finotti и соавт. установили, что при наличии в генотипе мутантных «нулевых» аллелей генов GSTM1 и GSTT1 у мужчин повышено число патологически измененных сперматозоидов [8]. Кроме того, имеются исследования, доказывающие роль цитогенетических нарушений в патологических изменениях сперматозоидов и бесплодии пациента, однако это заключение поддерживается далеко не всеми учеными [9,10].

Целью данной работы было изучение зависимостей между частотой различных форм тератозооспермии и кариопатологически измененных эпителиоцитов урогенитального тракта и носительством мутантных вариантов генов фермента глутатион-S-трансферазы (GSTM1 и GSTT1) у вахтовых рабочих-нефтяников, страдающих инфертильностью.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Обследовано 170 рабочих-нефтяников мужского пола в возрасте от 28 до 39 лет, впервые обратившихся к врачу-андрологу по поводу отсутствия потомства при состоянии в браке без применения контрацепции на протяжении нескольких лет и отсутствии у супруги, согласно медицинскому заключению, каких либо изменений, препятствующих зачатию. Для анализа у всех обследуемых были взяты образцы спермы и эпителий урогенитального тракта. Все обследованные дали документированное согласие на проведение настоящего исследования. Одновременно нами проведено анкетирование, позволяющее составить представление о факторах риска в жизнедеятельности обследуемого донора. У каждого человека анализировали не менее 1000 эпителиоцитов и сперматозоидов. Для морфологически нормального сперматозоида характерна овальная форма головки, длина ее составляет 5-6 мкм, ширина – 2,5-3,5 мкм, акросомальный участок занимает от 40 до 70% площади головки, при этом отсутствуют аномалии шейки, хвоста и срединного отдела. Отмечались выраженные изменения размеров головки, что подтверждалось путем измерения окуляр-микрометром. Изменения формы, дефекты акросомальной области, удвоение головки, а также аномалии шейки и хвоста оценивались визуально в соответствии с методическими указаниями ВОЗ и строгими критериями Крюгера [11,12].

Среди генов, задействованных в системе детоксикации, были изучены два полиморфных варианта генов GSTM1 и GSTT1, относительно которых имеются исследования, подтверждающие их протективную роль в отношении индукции ксенобиотиками хромосомных аномалий [13]. При анализе генов GSTM1 и GSTT1 на наличие делеций использовали мультиплексную ПЦР. В амплификационную пробу вносили две пары праймеров, что давало возможность одновременно амплифицировать фрагменты каждого из указанных генов. Разделение продуктов амплификации генов GSTM1 и GSTT1 проводили в горизонтальном 3% агарозном геле, приготовленном на однократном трис-боратном буфере с добавлением бромистого этидия и визуализацией в проходящем УФ-свете. Напряженность электрического поля при разделении фрагментов ДНК составляла 1-8 В/см2.

Нормальные аллели генов характеризуются присутствием ПЦРпродуктов: для GSTM1 – гомозиготы GSTM1(+/+) и гетерозиготы GSTM1(+/0); для GSTT1 – гомозиготы GSTT1(+/+) и гетерозиготы GSTT1(+/0). Делеционные («нулевые») гомозиготные варианты – GSTM1 (0/0) и GSTT1 (0/0) выявлялись по отсутствию фрагментов генов GSTM1 и GSTT1. Для генов GSTM1 и GSTT1 генотип 0/0 означает отсутствие на электрофореграмме фрагмента, соответственно, и данный индивидуум гомозиготен по делеции. Знак «+» означает присутствие фрагмента и данный донор либо гетерозиготен, либо гомозиготен по отсутствию делеции в указанных генах.

Статистическую обработку осуществляли с использованием пакета статистических программ STATISTICA v.6.0. Частоты гаплотипов сцепленных локусов для гена GSTM1, рассчитывали в программе “The EHsoware program, Rockefeller University, NY”. Все количественные показатели исследования обрабатывали с применением корреляционного анализа по Спирмену и t-критерия Стьюдента для независимых выборок, поскольку тестирование закона распределения при помощи критерия Колмогорова-Смирнова не выявило отличий от нормального. Анализ статистических различий качественных признаков производили с использованием теста χ2 с поправкой Йейтса на непрерывность [14]. Различия сравниваемых результатов (X±m, где X – выборочное среднее арифметическое, m – ошибка среднего арифметического) считались достоверными при достигнутом уровне значимости p<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Полученные данные свидетельствуют о том, что наблюдается четко выраженный полиморфизм в уровне кариопатологических изменений в эпителиоцитах урогенитального тракта у рабочих-нефтяников с инфертильностью в зависимости от их генотипа (табл. 1).

Таблица 1. Частота эпителиоцитов урогенитального тракта с кариопатологическими изменениями и показатели тератозооспермии у рабочих-нефтяников, страдающих инфертильностью, в связи с полиморфизмом мутантных «нулевых» аллелей генов GSTM1 и GSTT1, в сравнении с нормальным контролем – GSTM1(+)/GSTT1(+)

Примечание. Значимые различия показателей между когортами обследуемых рабочих, имеющих в генотипе нулевые аллели генов GSTM1(0/0) и GSTT1(0/0), и группой рабочих с нормальным генотипом GSTM1(+)/GSTT1(+) отмечены звездочками: * – при p<0,05; ** – при p<0,01; *** – при p<0,001

Особенно существенно повышенным был уровень кариопатологических нарушений у рабочих, имеющих сочетание гомозиготного нулевого генотипа одновременно по генам GSTM1 и GSTT1. Значимое повышенное число клеток с кариопатологическими изменениями было также зарегистрировано и для рабочих с инфертильностью, имеющих сочетание генов GSTM1 (0/0) и GSTT1 (+), по сравнению с нормальными гомозиготами – GSTM1(+)/ GSTT1(+) и гетерозиготами GSTM1(+)/ GSTT1(0/0). Среди наблюдаемых аберраций наиболее часто наблюдались клетки с микроядрами и протрузиями, которые можно отнести к истинным цитогенетическим аберрациям, поскольку они образуются в результате образования ацентрических фрагментов хромосом и отставания в митозе отдельных целых хромосом [13]. Частота клеток с микроядрами у рабочих с инфертильностью, имеющих нулевой гомозиготный генотип по генам GSTM1 и GSTT1, превышала контрольный уровень в 2,6 раза (11,2± 1,4‰ при 4,3±0,3‰ в контроле; p<0,001), протрузии типа «разбитое яйцо» – в 9,8 раза (4,9±0,1‰ и 0,5± 0,2‰; p<0,05) и типа «язык» – в 5,5 раза (2,2±0,3‰ и 0,4±0,2‰; p<0,01). Ранняя деструкция ядра цитологически начинается как перинуклеарная вакуоль [18], не исключено, что такой показатель как центральная круговая насечка также свидетельствует о разрушении ядерной оболочки. В контроле этот показатель составил 2,1±0,4‰, а у рабочих с генотипом GSTM1(0/0)/GSTT1(0/0) – 5,8±0,4‰ (p<0,05). Апоптотический процесс распада хроматина ядра может выглядеть как кариолизис. Кариорексис это заключительный этап гибели клетки, часто образующийся при формировании многогруппового аномального митоза [6]. У рабочих с инфертильностью, имеющих нулевые гомозиготы по генам GSTM1 и GSTT1, число клеток с перинуклеарной вакуолью было значимо выше, чем в контрольной группе (p<0,001). То же самое можно сказать и о частоте клеток с кариорексисом (p<0,001) и кариолизисом (p<0,01). Возрастание числа клеток с кариопикнозом у рабочих с инфертильностью, имеющих гомозиготный нулевой генотип по гену GSTM1(0/0), может, по-видимому, свидетельствовать об уменьшении гетерохроматизации в экспрессируемых участках генома эпителиоцитов [15].

В научной литературе имеются данные, свидетельствующие о том, что нулевые генотипы по глутатион-S-трансферазе (GSTM1 и GSTT1) ассоциированы с более высоким уровнем цитогенетических аберраций [16]. Полученные нами данные подтверждают это заключение в отношении гомозиготного нулевого генотипа GSTM1(0/0). В настоящем исследовании мы не обнаружили по изучаемым показателям различий между рабочими, имеющими гомозиготный нулевой генотип GSTM1(0/0)/GSTT1(0/0) и GSTM1(0/0)/GSTT1(+), что можно объяснить более значительным влиянием на кариопатологические последствия гена GSTM1(0/0), чем GSTT1 (0/0).

Анализ морфологических изменений сперматозоидов свидетельствует о том, что у рабочих с инфертильностью наблюдается значительное возрастание в семенной жидкости числа сперматозоидов с дефектами головки. У рабочих GSTM1(0/0), по сравнению с контролем, во много раз возрастало число сперматозоидов с изменением размеров и формы головки, а также с аномалиями акросомальной области, двойной головкой и дефектами шейки, при этом значимого увеличения частоты сперматозоидов с дефектами в области хвоста не отмечено (табл. 1).

Корреляционный анализ по результатам обследования рабочих с инфертильностью, являющихся носителями двойного гомозиготного нулевого генотипа GSTM1(0/0)/GSTT1(0/0), показал достоверную положительную связь между числом эпителиоцитов с микроядрами, а также пикнозом ядра с одной стороны и изменением размеров сперматозоидов с другой (в обоих случаях p<0,01) (табл. 2). При этом у рабочих отмечены случаи глобозооспермии, когда головка сперматозоида не имеет акросомы и она исключительно маленьких размеров. Мы склонны считать, что одновременное отставание нескольких хромосом при делении клетки может приводить к появлению крупных микроядер и формированию сперматозоидов с маленькой головкой. Кластогенные процессы в клетках рабочих нефтепромыслов, сопровождающиеся аномальным расхождением нескольких хромосом показаны нами ранее [17]. Центральная круговая насечка ядерной оболочки имела значимые корреляционные зависимости от нескольких показателей аномалий сперматозоидов, включая дефект формы (p<0,05) и увеличение числа головок (p<0,01). Ядра с круговой насечкой, по мнению некоторых ученых, формируются в результате аномального строения ахроматинового веретена деления клетки, при этом не образуется перегородка между дочерними ядрами и дефектно проходит кариотомия [18]. Образование двуядерных эпителиоцитов имелo значимые корреляционные зависимости от увеличения показателя сператозоидов, имеющих две головки (p<0,01). По-видимому, об этом же свидетельствует рост числа полиплоидных клеток у рабочих нефтепромыслов, что показано нами ранее [17]. Появление протрузий имело достоверную связь с изменением формы сперматозоидов. Возможно, это явление связано с изменением прочности и эластичности ядерной оболочки, что, по-видимому, может отражаться на формировании формы головки при сперматогенезе. Наблюдается также достоверная корреляционная связь между формой головки и такими показателями как кариорексис (p<0,01) и наличием в ядре перинуклеарных вакуолей (p<0,001). Не исключено, что сопряженные изменения в эпителии урогенитального тракта и тератозооспермия обусловлены наличием эндогенных генотоксикантов. Известно, что сперматозоиды спонтанно производят разнообразные активные формы кислорода, включая супероксид аниона, перекись водорода и окись азота и эта активность частично контролируется ферментной системой глютатионS-трансферазы что, в свою очередь, может, по-видимому, способствовать кариопатологическим изменениям эпителиоцитов в урогенитальном тракте человека, особенно в случае носительства гомозиготного нулевого генотипа GSTM1 (0/0) [1].

Таблица 2. Коэффициенты корреляции между показателями кариопатологических изменений в эпителиоцитах урогенитального тракта и тератозооспермии в семенной жидкости у рабочих с инфертильностью, гомозиготных по нулевым аллелям генов глутатион-S-трансферазы – GSTM1 (0/0)/GSTT1 (0/0)

Известно, что курение может приводить к повышению числа клеток с цитогенетическими нарушениями в организме человека-носителя мутантных («нулевых») аллелей фермента глутатион-S-трансферазы [16]. Анкетные данные по этому вопросу свидетельствуют, что число курящих во всех когортах рабочих было практически одинаковым (28,9-31,2%). Существенного повышения числа кариопатологических изменений и показателей тератозооспермии у курящих нами не наблюдалось. Несомненно, что в экстремальных условиях нефтедобычи на севере Западной Сибири имеется множество мощных факторов, которые могут оказывать не только мутагенное, но и ко-мутагенное действие. Помимо антропогенных факторов, это и природные факторы: низкие температуры, мощные геомагнитные поля авроральной зоны, геомагнитные аномалии, особенности светового режима (полярные ночь и день) и дефицит некоторых жизненно важных микроэлементов [17].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Полученные нами результаты свидетельствуют о том, что у рабочих нефтяников с инфертильностью наблюдаются статистически значимые изменения частоты кариопатологических нарушений эпителиоцитов урогенитального тракта и показателей тератозооспермии, в зависимости от генетического полиморфизма генов системы детоксикации ксенобиотиков GSTM1 и GSTT1, который выражается в наличии (или отсутствии) в генотипе мутантных «нулевых» аллелей этих генов. Показано, что у лиц, гомозиготных по «нулевому» аллелю гена GSTM1(0/0) значимо повышено число эпителиоцитов урогенитального тракта с микроядрами, протрузиями, насечками ядра, перинуклеарными вакуолями, кариолизисом и кариорексисом, а также уровни показателей, характеризующих тератозооспермию, по сравнению с рабочими-нефтяниками, которые имеют нормальный генотип – GSTM1(+)/GSTT1(+). При наличии гомозиготных «нулевых» аллелей генов GSTT1(0/0) такой закономерности не отмечено. Статистический анализ позволяет заключить, что имеется значимая связь между некоторыми формами кариопатологических изменений эпителиоцитов и показателями различных типов тератозооспермии, что может свидетельствовать в пользу вывода о корреляционной зависимости между наблюдаемыми изменениями в соматических и генеративных клетках у рабочих нефтепромыслов севера Западной Сибири.

ЛИТЕРАТУРА

1. Chemes EH, Rawe YV. Sperm pathology: a step beyond descriptive morphology. Origin, characterization and fertility potential of abnormal sperm phenotypes in infertile men. Hum Reprod Update. 2003;9(5):405–428.

2. Said TM, Agarwal A, Sharma RK, Thomas AJJr, Sikka SC. Impact of sperm morphology on DNA damage caused by oxidative stress induced by beta-nicotinamide adenine dinucleotide phosphate. Fertil Steril. 2005;83:95–103.

3. Guzick DS, Overstreet JW, Factor-Litvak P, Brazil CK, Nakajima ST, Coutifaris C, et al. Sperm morphology, motility, and concentration in fertile and infertile men. N Engl J Med 2001;345:1388–1393.

4. Артифексов С. Б. Андрологические аспекты бесплодного брака. Урология и нефрология 1996;(4): 39–41.

5. Burrello N. Lower sperm aneuploidy frequency is associated with high pregnancy rates in ICSI programmes. Human Reproduction. 2003;18:1371–1376.

6. Ильинских Н.Н., Васильев С.А., Кравцов В.Ю. Микроядерный тест в скрининге и мониторинге мутагенов. Saarbrucken (Germany): LAP LAMBERT Academic Publishing GmbH&Co. 2011; 216 с.

7. Ильинских Н.Н., Ильинских И.Н., Ильинских Е.Н., Юркин А.Ю., Шилов Б.В. Влияние генетического полиморфизма на цитогенетические последствия условий труда у рабочих на нефтепромыслах Сибири. Токсикологический вестник 2011;(5):34–40.

8. Finotti AC, Costa-Silva RCP, Bordin BM, Silva CTX. and Moura KKVO. GlutathioneS-transferase M1 and T1 polymorphism in men with idiopathic infertility. Genet Mol Res 2009;8(3):1093–1098.

9. Nakamura Y, Kitamura M, Nishimura K, Koga M, Kondoh N, Takeyama M, et al. Chromosomal variants among 1790 infertile men. Int J Urol 2001;8(2):49-52.

10. Neischlag E, Behre H. Andrology: Male reproductive health found disfunction. Berlin: Springer. 1997; 320 p.

11. WHO Laboratory Manual for the Examination of Human Semen and Semen-Cervical Mucus Interaction. 3rd edition. Cambridge: Cambridge University Press. World Health Organization. 1992; 234 p.

12. Check JH, Adelson HG, Schubert BR, Bollendorf A. Evaluation of sperm morphology using Kruger's strict criteria. Arch Androl 1992;28(1):15–17.

13. Kumar M, Chauhan LK, Paul BN. GSTM1, GSTT1, and GSTP1 polymorphism in north Indian population and its influence on the hydroquinone-induced in vitro genotoxicity. Toxicol Mech Methods 2009;19(1): 59–65.

14. Боровиков В.П., Боровиков И.П. Статистический анализ и обработка данных в среде Windows. М.: «Филинъ». 1997; 608 с.

15. Ченцов Ю. С. Введение в клеточную биологию. М.: Академкнига. 2004; 284 с.

16. Scarpato R, Hirvonen A, Migliore L. Influence of GSTM1 and GSTT1 polymorphisms on the frequency of chromosome aberrations in lymphocytes of smokers and pesticide-exposed greenhouse workers. Mutat Res 1997;389(3):227–235.

17. Ильинских Н.Н., Язиков Е.Г., Ильинских Е.Н., Ямковая Е.В., Ильинских И.Н., Шилов Б.В. Феногенетические маркеры адаптогенеза к условиям нефтегазопромыслов севера Сибири (новые технологии отбора контингента трудовых ресурсов на нефтегазопромыслы севера Сибири). Томск: ТПУ. 2012; 420 с.

18. Мейер А.В., Дружинин В.Г., Ларионов А.В. Генотоксические и цитотоксические эффекты в буккальных эпителиоцитах детей, проживающих в экологически различающихся районах Кузбасса. Цитология 2010;52(4): 305–310.

БЛАГОДАРНОСТЬ. Настоящая работа выполнена при финансовой поддержке грантов РФФИ № 16-44-700149 и РГНФ № 06-15-10190

Журнал "Экспериментальная и клиническая урология" Выпуск № 3 за 2016 год