Евдокимов В.В., Исаев Н.К., Туровецкий В.Б., Пирутин С.К.

Сведения об авторах:

• Евдокимов В.В. – д.м.н., гл. научный сотрудник отдела андрологии и репродукции человека НИИ урологии и интервенционной радиологии им.Н.А. Лопаткина – филиал ФГБУ «НМИЦ радиологии» Минздрава России, vvevdok@ mail.ru. AuthorID 543052
• Исаев Н.К. – д.б.н., ведущий научный сотрудник, Факультет биоинженерии и биоинформатики МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва, NikIsaev@mail.ru; AuthorID 89160
• Туровецкий В.Б. – к.б.н., старший научный сотрудник МГУ им. М.В. Ломоносова, Биологический факультет, vbturovet@rambler.ru, AuthorID 85978
• Пирутин С. К. – к.б.н., старший научный сотрудник МГУ имени М.В. Ломоносова, Биологический факультет, Pirutin S.K.@yandex.ru, AuthorID 91321

В настоящее время демографическая ситуация в стране характеризуется падением рождаемости. Эта тенденция по оценкам демографов сохранится на протяжении нескольких лет. По данным ВОЗ процент бесплодного брака в разных странах достигает 10-15% от общего числа супружеских пар. В Российской Федерации по данным Национального медицинского исследовательского центра акушерства, гинекологии и перинатологии им. В.И. Кулакова это число составляет 17%, а у более 4 млн мужчин диагностировано бесплодие различной формы [1-3].

В последние годы нарушения репродуктивной функции у мужчин имеют особую медицинскую и социальную значимость в связи с прогрессирующим снижением фертильных свойств сперматозоидов [4,5]. Нарушения фертильности рассматривают как многофакторное состояние, которое может быть опосредовано наличием патологических изменений в органах половой системы (варикоцеле, простатит, инфекции, передающиеся половым путем, крипторхизм, гипогонадизм и др.), а также влиянием внешних факторов (курение, алкоголь, гиподинамия, ожирение, электро-магнитное излучение различных источников, неблагоприятные экологические факторы, профвредности) [6]. Эти воздействия могут влиять одновременно, усиливая изменения репродуктивной функции, и вызывать нарушения гормонального профиля. По всей вероятности, совокупность этих факторов приводит к высокому проценту идиопатической формы бесплодия, доходящему до 30-50% в структуре мужского бесплодия, что вызывает не только сложность диагностики, но и выбор лечебной тактики выявленных нарушений [7].

До настоящего времен лечение и диагностика мужского бесплодия остаются малоэффективными, коррекция нарушений мужской фертильности не всегда приводят к положительным результатам. В этом случае для нормализации структурно-функционального состояния мужских половых клеток используют гормональные препараты, витамины, микроэлементы, антиоксиданты и др. Однако эффект такого лечения не всегда удовлетворяет и пациента и врача. Поэтому одной из актуальных задач современной андрологии является поиск агентов, способных повышать подвижность сперматозоидов, а также увеличивать их устойчивость к воздействию повреждающих факторов различной природы.

Ранее нами был выполнен ряд экспериментов, направленных на поиск способов повышения мужской фертильности путем увеличения подвижности сперматозоидов при помощи регуляторных пептидов [8] или белково-пептидный комплекса (БПК), полученного из семенников быка. [9]. Исследования показали, что регуляторные пептиды и препараты БПК обладали ярко выраженной способностью увеличивать как активную, так и общую подвижность сперматозоидов.

В последствии, проведенный анализ литературы указал на возможность использования метиленовой сини (МС) в качестве агента, влияющего функциональную активность сперматозоидов [10,11]. Мы предположили, что увеличить подвижность сперматозоидов можно с помощью веществ, которые непосредственно способны влиять на функционирование митохондрий, одним из таких агентов является метиленовый синий. В ряде работ отмечен позитивный эффект воздействия метиленового синего, где развитие клеточного повреждения связано с нарушением митохондриальных функций [12]. В настоящее время МС используется в медицине в качестве антисептика и для лечения метгемоглобинемии, вазоплегического синдрома и фосфамидной нейротоксичности. Более того, на моделях инсульта, болезней Альцгеймера и Паркинсона показаны нейропротекторные свойства МС [13, 14]. Авторы связывают защитный эффект с тем, что МС усиливает аутофагию, снижает отек головного мозга, а также ингибирует активацию микроглии и уменьшает воспаление. Следует отметить, что химически это вещество является трициклическим фенотиазином [15] и в митохондриях может исполнять роль катализатора окислительно-восстановительного цикла.

M. Oz и соавт. продемонстрировали эффект действия МС в эксперименте. Ими было показано, что этот препарат способен снижать нарушения органных функций крыс, вызванных воздействием ряда повреждающих факторов. В экспериментах in vitro показано, что МС эффективно снижает гибель культивированных нейронов, вызванную паракватом или ионами цинка, токсическое действие которых направленона митохондрии [14].

В связи с вышеизложенным, задачей данной работы является исследование биологического действия препарата метиленовой сини на подвижность и жизнеспособность сперматозоидов человека.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Исследования проводили на сперматозоидах человека из эякулята, полученного общепринятым способом. После разжижения через 40-60 мин эякулят микроскопировали в проходящем свете при увеличении х400 на микроскопе Amplival (Karl Zeiss, Iena). Оценку подвижности сперматозоидов и другие параметры эякулята осуществляли по стандарту ВОЗ 5-го издания [16]. Эксперименты проводили при температуре 20–22ºС. Из полученного образца эякулята отбирали по 1 мл для опыта и контроля. В опытную пробирку вносили препарат МС до конечной концентрации 1 нМ.

Полученные результаты представлены в виде средних арифметических значений исследованных параметров и их среднеквадратических ошибок. Результаты экспериментов обрабатывали статистически с использованием критерия Стъюдента. Различия между средними арифметическими значениями параметров считали достоверными при р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Мы провели ряд экспериментов с подвижными клетками – сперматозоидами. В одной серии опытов использовали эякулят (13 пациентов) с исходной низкой подвижностью сперматозоидов (табл. 1). В другой серии были использованы образцы эякулята (10 пациентов) с исходной нормальной подвижностью сперматозоидов (табл. 2). Подвижность сперматозоидов (общая, активная и малая) рассчитывалась как содержание в эякуляте подвижных клеток на 100 проанализированных. Общая подвижность – сумма фракций активной и малой подвижности. В таблицах скобках даны результаты относительно исходного уровня, принятого за относительные 100%.

При исходной астенозооспермии (табл. 1) активная подвижность значительно выросла в первые 30 мин опыта, затем снизилась до исходного уровня. Малая подвижность через 2 часа наблюдения заметно снижалась, общая подвижность также после некоторого повышения упала до исходного уровня.

Таблица 1. Влияние метиленовой сини на подвижность сперматозоидов при исходной астенозооспермии (общая подвижность – менее 40%)
Table 1. The effect of methylene blue on sperm motility in the initial asthenozoospermia (total motility – less than 40%)

* различия величин подвижности по сравнению с исходным уровнем достоверны (р<0,05).

При нормозооспермии (табл. 2) активная подвижность существенно изменялась на протяжении 2 часов наблюдения. Малая подвижность сперматозоидов изменялась за этот период менее существенно, общая подвижность значительно возрастала в первые 30 мин, затем снижалась до исходного уровня. При этом можно выделить более выраженный ответ активноподвижных форм сперматозоидов на воздействие препарата.

Таблица 2. Влияние метиленовой сини на подвижность сперматозоидов при исходной нормозооспермии
(общая подвижность – менее 40%)
Table 1. The effect of methylene blue on sperm motility in the initial normozoospermia (total motility – less than 40%)

* различия величин подвижности по сравнению с исходным уровнем достоверны (р<0,05).

В контрольных образцах подвижность через 2 часа наблюдения во всех случаях сохранялась на исходном уровне.

Число живых форм сперматозоидов на протяжении времени проведения эксперимента в обоих случаях (астенои нормозооспермия) сохранилось на исходном уровне 60 – 64%.

Таким образом, добавление МС в эякулят в пределах 30 – 60 мин. инкубации изменяло в разной степени все формы подвижности сперматозоидов. При увеличении времени инкубации эффект возрастания подвижности сперматозоидов не наблюдался.

ОБСУЖДЕНИЕ

Полученные результаты исследования воздействия МС на сперматозоиды с ведущей формой патоспермии – астенозооспермией показывают наличие существенных изменений основных функциональных параметров эякулята. Ответ сперматозоидов на воздействие МС в разных группах различен и по времени и по эффекту. Наиболее выражен рост подвижности во фракции активноподвижных сперматозоидов в первые 30 – 60 мин опыта. Через 2 часа во всех образцах эякулята, включая контроль, подвижность возвращалась к исходному уровню. Через 24 часа наблюдения все виды подвижности снижались до 20-50% по отношению к исходному уровню, в контроле – до 2-60%.

В настоящее время механизм восстанавливающего и стимулирующего действия препарата на различные клетки окончательно не ясен, однако, в литературе имеются указания на то, что эти свойства в определенной степени связаны с влиянием на кальциевый гомеостаз и функциональное состояние митохондрий [17,18].

Было показано, что МС способен снижать нарушения органных функций крыс в результате воздействия ряда повреждающих факторов. В экспериментах in vitro показано, что МС эффективно снижает гибель культивированных нейронов, вызванную паракватом или ионами цинка, токсическое действие которых направлено на митохондрии [19,20].

Кроме того, как известно, подвижность сперматозоидов обеспечивается за счет энергии гликолиза, одним из ферментов которого является глицеральдегид3-фосфатдегидрогеназа – ГАФДс, прочно связанная в сперматозоиде с фиброзным слоем жгутика [21]. По мнению авторов, подвижность сперматозоидов в существенной степени зависит от активности этого фермента, который весьма чувствителен к повреждающему действию активных форм кислорода (АФК). Это позволяет предположить, что возрастания подвижности сперматозоидов можно добиться с помощью ряда агентов (в том числе, возможно, и некоторых регуляторных пептидов), снижающих повышенную продукцию АФК, которая отмечается при ряде урологических заболеваний, в том числе органов урогенитальной системы.

Таким образом, проведённые исследования выявили способность МС стимулировать подвижность сперматозоидов человека в эксперименте. Хотя механизм наблюдаемого эффекта остается пока неясным, полученные данные показывают перспективность проведения дальнейших работ по изучению возможности использования препарата в андрологической и репродуктивной практике.

ЛИТЕРАТУРА

1. Щеплев П.А. Андрология. Клинические рекомендации. М., Медпрактика. 2007. 154 с. (Scheplev P.A. Andrology. Clinical recommendations. M., medical practice. 2007.154 s.)
2. Кулаков В.И. Вспомогательные репродуктивные технологии настоящее и будущее. М. Мединформагенство. 2005. C. 11-15. (Kulakov V.I. Assisted reproductive technologies present and future. M. Medical news. 2005.P. 11-15.)
3. Пашкова Е.Ю., Калинченко С.Ю. Мужское бесплодие в ХХ1 веке – реалии и перспективы. Эффективная фармакотерапия. Урология и нефрология 2013;(1): 26-32. (Pashkova E.Yu., Kalinchenko S.Yu. Male infertility in the 21st century realities and prospects. Effective pharmacotherapy. Urology and Nephrology 2013; (1): 26-32.)
4. Виноградов И.В., Габлия М.Ю. Роль мужского фактора при анализе неудач в протоколах ВРТ. URL: http://uronews.ru/2012/10/vliyanie-muzhskogo-faktora-na-veroyatnostneudachi-v-protokole-vrt/. (Vinogradov I.V., Gabliya M.Yu. e role of the male factor in the analysis of failures in ART protocols. URL: http://uronews.ru/2012/10/vliyanie-muzhskogofaktora-na-veroyatnost-neudachi-v-protokole-vrt/)
5. Овчинников Р.И., Гамидов С.И. Причины репродуктивных потерь у мужчин – фрагментация ДНК сперматозоидов. РМЖ 2015;(11):634-638. (Ovchinnikov R.I., Hamidov S.I. The causes of reproductive loss in men are sperm DNA fragmentation. RMJ 2015; (11): 634-638.)
6. Быков В.Л. Сперматогенез у мужчин в конце ХХ века (обзор литературы). Проблемы репродукции 2000;(1): 6-13. (Bykov V.L. Spermatogenesis in men at the end of the twentieth century (literature review). Reproduction Problems 2000; (1): 6-13.)
7. Келлэт Е.П., Корнеева И.Е., Шуршалина А.В. Бесплодие неясного генеза: фокус современных научных исследований. Проблемы репродукции 2010;(1): 32-35. (Kellat E.P., Korneeva I.E., Shurshalina A.V. Infertility of unknown origin: the focus of modern scientific research. Reproduction Issues 2010; (1): 32-35.)
8. Евдокимов В.В., Захариков С.В., Андреева Л.А., Мясоедов Н.Ф., Туровецкий В.Б. Влияние регуляторных пептидов на подвижность сперматозоидов человека in vitro. Экспериментальная и клиническая урология 2016;(2):67–69. (Evdokimov V.V., Zakharikov S.V., Andreeva L.A., Myasoedov N.F., Turovetsky V.B. e effect of regulatory peptides on in vitro human sperm motility. Experimental and clinical urology 2016; (2): 67–69.)
9. Ямскова В.П., Краснов М.С., Ямсков И.А. Новые экспериментальные и теоретические аспекты в биорегуляции. Механизм действия мембранотропных гомеостатических тканеспецифических биорегуляторов. Saarbucken. Lambert Academic Publishing, 2012. 127 с. (Yamskova V.P., Krasnov M.S., Yamskov I.A. New experimental and theoretical aspects in bioregulation. The mechanism of action of membranotropic homeostatic tissue-specific bioregulators. Saarbucken Lambert Academic Publishing, 2012.127 p.)
10.  Wood BL, Doncel GF, Reddy PR, Sokal DC. Effect of diltiazem and methylene blue on human sperm motility, viability and cervical mucus penetration: potential use as vas irrigants at the time of vasectomy. Contraception 2003;67(3):241-5.
11. Chandler JE, Harrison CM, Canal AM. Spermatozoal methylene blue reduction: an indicator of mitochondrial function and its correlation with motility. Theriogenology 2000;15;54(2):261-71.
12. Wainwright M, Amaral L. The phenothiazinium chromophore and the evolution of antimalarial drugs. Trop Med Int Health 2005;10(6):501–511. doi: 10.1111/j.1365-3156.2005.01417.x
13. Watts LT, Lloyd R, Garling, R.J. Stroke neuroprotection: targeting mitochondria. Brain Sci 2013;3(2):540-560. doi: 10.3390/brainsci3020540.
14. Oz M, Lorke DE, Petroianu GA. Methylene blue and Alzheimer's disease. Biochem Pharmacol 2009. 78, 927-932.
15. Стельмашук Е.В., Генрихс Е.Е., Мухалева Е.В., Скребицкий В.Г., Исаев Н.Л. Нейропротекторное действие метиленовой сини in vivo и in vitro. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины 2019;167(4): 438-443. (Stelmashuk E.V., Genrikhs E.E., Mukhaleva E.V., Skrebitsky V.G., Isaev N.L. Neuroprotective effect of methylene blue in vivo and in vitro. Bulletin of experimental biology and medicine 2019; 167 (4): 438-443.)
16. Руководство ВОЗ по исследованию и обработке эякулята человека. 5-е изд. 2012, М.: 291 c. (WHO guidelines for the study and treatment of human ejaculate. 5th ed. 2012, M .: 291 c.)
17. Poteet E, Winters A, Yan LJ, Yang SH. Neuroprotective action of methylene blue and its derivatives. PLoS One 2012;7(10):e48279. doi: 10.1371/journal.pone.0048279.
18. Zhao M, Liang F, Xu H, Yan W, Zhang J. Methylene blue exerts a neuroprotetive effect against traumatic brain injury by promoting autophagy and ingibiting microglial activation. Mol Med Rep 2016;13(1):13-20. doi: 10.3892/mmr.2015.4551
19. Sharpley MS, Hirst J. The inhibition of mitochondrial complex1 (NADH:ubiquinone oxidoreductase) by Zn2+. J Biol Chem 2006;281(46):34800-9.
20.  Suh SW, Chen JW, Motamedi M, Bell B, Listiak K, Pons NF, et al. Evidence that synaptically – released zinc contributes to neuronal injury after traumatic brain injury. Brain Res 2000;852(2):268-273.
21. Шуцкая Ю.Ю., Элькина Ю.Л., Муронец В.И. Исследование глицеральдегид – 3фосфатдегидрогеназы из сперматозоидов человека. Биохимия 2008;73(2):228-236. (Shutskaya Yu.Yu., Elkina Yu.L., Muronets V.I. The study of glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase from human sperm. Biochemistry 2008; 73 (2): 228-236.)

Статья опубликована в журнале "Экспериментальная и клиническая урология" №3 2019, стр. 50-53